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SPA的純化

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-06-28

1.DEAE-Sephadex A-25離子交換層析法

⑴ 用0.1mol/L NH4HCO3緩沖液平衡DEAE-Sephadex A-25柱。

⑵ 加樣后,用0.1mol/L NH4HCO3緩沖液洗脫12h~14h。

⑶ 改用0.4mol/L NH4HCO3緩沖液洗脫,流速0.15ml~0.2ml/min,收集流出液,測OD275nm。

⑷ 測SPA活性(以對流免疫電泳),能與人及豬正常血清產生沉淀線的各管合并。

⑸ 濃縮或凍干保存。

2.Sphadex G100凝膠過柱法

裝柱、加樣,以0.05mol/L pH7.4 PBS洗脫,收集洗脫液,如上法測定活性和蛋白含量。

3.親和層析法

(1) 豬IgG的制備:取正常豬血清,硫酸銨提取 球蛋白,再過DEAE-纖維素-32柱,制得純化的IgG,以0.1mol/L NaHCO3液平衡,配成4mg~5mg/ml溶液。

(2) 偶聯:將固體溴化氰1.2g溶于20ml蒸餾水中,傾入容積為15ml的Sepharose-4B中,攪拌,同時滴加2mol/L NaOH使pH維持在11.0,反應8min,用500ml預冷的0.1mol/L NaHCO3在2號砂芯漏斗上洗脫已活化的Sepharose-4B(在90Sec內洗脫完畢),迅速加入IgG液15ml,于4℃緩慢攪拌過夜,次日以PBS充分洗滌,至洗出液OD280nm<0.02為止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱,以封閉殘余活性基團,再以PBS洗至中性為止。

(3) PBS親和層析:將粗制SPA溶于PBS液中,加入IgG-Sepharose-4B柱,流速0.2ml/min,以PBS洗至OD280nm<0.02為止,換用0.1mol/L pH2.3甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫,流速0.2ml/min,收集洗脫液,即為純化的SPA,對流電泳檢查SPA活性,收集,濃縮,保存。

 
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