在生物體內膽甾醇從乙酰輔酶A生物合成。三分子乙酰CoA（C₂）縮合，經(jīng)由乙酰乙酰CoA（C₄）而成為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A，它的硫酯基被還原而生成甲羥戊酸（C₆）。由于甲羥戊酸的磷酸化和隨后發(fā)生的脫羧和脫水而生成異戊烯焦磷酸（C₅）和二甲基丙烯焦磷酸（C₅）。后二者，順次結合而生成牻牛兒醇焦磷酸（C₁₀）。繼而變成法尼焦磷酸（C₁₅），二分子法尼焦磷酸結合而成〔角〕鯊烯（squalene）（C₃₀），〔角〕鯊烯氧化性閉環(huán)成為羊毛甾醇（C₃₀）。最后，在羊毛甾醇的4和14位上的3個甲基脫掉，Δ²⁴的雙鍵飽和以及Δ⁸雙鍵向Δ⁶位移動而得到膽甾醇。結果膽甾醇的27個碳原子都是來自醋酸（15個來自醋酸的甲基碳素，12個來自羧基碳素）。幾乎所有的組織都可從醋酸合成膽甾醇。參與膽甾醇合成的酶都含于微粒體中，細胞的可溶性部分存在著促進因子，C₂₈及C₂₉甾體生物合成最初也經(jīng)歷著和膽甾醇一樣的途徑，形成甾體核，以后，在側鏈24位上引入來自蛋氨酸甲基的碳原子。