質粒、噬菌體等經酶切,電泳;PCR產物經電泳后,常常需要對一些DNA電泳片段進行回收和純化,用于亞克隆、探針標記等。DNA回收和純化常用方法有壓碎法、低融點瓊脂糖法、凍融法等,也有現成的試劑盒供應。
一、凍融法
1. 紫外燈下仔細切下含待回收DNA的膠條,將切下的膠條(小于0.6g)搗碎,置于1.5ml離心管中;
2. 加入等體積的Tris-HCl飽和酚(pH 7.6),振蕩混勻;
3. -20℃放置5-10min;
4. 4℃離心10000g×5min,上層液轉移置另一離心管中;
5. 加入1/4體積H2O于含膠的離心管中,振蕩混勻;
6. -20℃,放置5-10min;
7. 4℃離心10000g×5min,合并上清液;
8. 用等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次,取上清;
9. 加入1/10體積3M NaAc(pH 5.2)、2.5倍體積預冷的無水乙醇,混勻;
10. -20℃,靜置30min;
11. 4℃離心13000g×10min,棄上清,75%乙醇洗沉淀1-2次,晾干;
12. 加適量H2O或TE溶解沉淀。
二、DNA回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit Protocol)
1. 紫外燈下仔細切下含待回收DNA的凝膠,置1.5ml離心管中,稱重。
2. 加入Buffer QG(每100mg凝膠加Buffer QG 300μl),置50℃水浴10min。
3. 若回收片段小于500bp或大于4kb,則需加入異丙醇(每100mg凝膠加異丙醇100μl),混勻。
4. 將小柱放在2ml收集管上,將上述溶液加于柱上。
5. 4℃離心13000g×1min,棄去收集管中液體。
6. 加入500μl Buffer QG于柱上,4℃離心13000g×1min,棄去收集管中液體。
7. 加入750μl Buffer PE于柱上,4℃離心13000g×1min,棄去收集管中液體。
8. 4℃離心13000g×1min。棄去收集管。
9. 將柱放于一新1.5ml離心管上,加50μl EB于柱上。放置1min,4℃離心13000g×1min。
10. 取5μl 回收DNA電泳檢測。
三、 注意事項
紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時,要襯以干凈的塑料薄膜,使用無DNA污染的新刀片,其目的在于防止外源DNA的污染。
一、凍融法
1. 紫外燈下仔細切下含待回收DNA的膠條,將切下的膠條(小于0.6g)搗碎,置于1.5ml離心管中;
2. 加入等體積的Tris-HCl飽和酚(pH 7.6),振蕩混勻;
3. -20℃放置5-10min;
4. 4℃離心10000g×5min,上層液轉移置另一離心管中;
5. 加入1/4體積H2O于含膠的離心管中,振蕩混勻;
6. -20℃,放置5-10min;
7. 4℃離心10000g×5min,合并上清液;
8. 用等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次,取上清;
9. 加入1/10體積3M NaAc(pH 5.2)、2.5倍體積預冷的無水乙醇,混勻;
10. -20℃,靜置30min;
11. 4℃離心13000g×10min,棄上清,75%乙醇洗沉淀1-2次,晾干;
12. 加適量H2O或TE溶解沉淀。
二、DNA回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit Protocol)
1. 紫外燈下仔細切下含待回收DNA的凝膠,置1.5ml離心管中,稱重。
2. 加入Buffer QG(每100mg凝膠加Buffer QG 300μl),置50℃水浴10min。
3. 若回收片段小于500bp或大于4kb,則需加入異丙醇(每100mg凝膠加異丙醇100μl),混勻。
4. 將小柱放在2ml收集管上,將上述溶液加于柱上。
5. 4℃離心13000g×1min,棄去收集管中液體。
6. 加入500μl Buffer QG于柱上,4℃離心13000g×1min,棄去收集管中液體。
7. 加入750μl Buffer PE于柱上,4℃離心13000g×1min,棄去收集管中液體。
8. 4℃離心13000g×1min。棄去收集管。
9. 將柱放于一新1.5ml離心管上,加50μl EB于柱上。放置1min,4℃離心13000g×1min。
10. 取5μl 回收DNA電泳檢測。
三、 注意事項
紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時,要襯以干凈的塑料薄膜,使用無DNA污染的新刀片,其目的在于防止外源DNA的污染。