對(duì)未知突變進(jìn)行分析的方法

1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage)在一定條件下,異源雙鏈核酸分子RNA:RNA或RNA:DNA中的錯(cuò)配堿基可被RNaseA切割,切割產(chǎn)物可通過(guò)跑變性膠得到分離。RNA探針可通過(guò)將相應(yīng)的DNA片段克隆至含有SP6或T7啟動(dòng)子的載體中得到,當(dāng)RNA探針上錯(cuò)配的堿基為嘌呤時(shí),RNaseA在錯(cuò)配處的切割效率很低甚至不切割,而當(dāng)錯(cuò)配堿基為嘧啶時(shí),則其切割效率較高。所以如果僅分析被檢DNA的一條鏈,其突變檢出率只有30%,而如果同時(shí)分析被檢DNA的正義鏈和反義鏈,則有效率可達(dá)到70%[1]。盡管RNaseA切割法有其局限性,如需使用同位素,需將PCR產(chǎn)物克隆至表達(dá)載體上,從而增加了操作的復(fù)雜度,但由于它能對(duì)1～2kb的片段進(jìn)行檢測(cè),并能確定突變位置,且無(wú)需使用有害化學(xué)試劑,故仍被頻繁使用。

2.變性梯度凝膠電泳(DGGE)
該方法的原理是:雙鏈DNA分子在一定變性劑濃度的凝膠上電泳時(shí),會(huì)在一定的時(shí)間發(fā)生部分解鏈,導(dǎo)致電泳遷移率下降,當(dāng)正常的DNA分子和發(fā)生突主的DNA分子之間即使只有一個(gè)堿基對(duì)的差異時(shí),也會(huì)在不同時(shí)間發(fā)生部分解鏈,從而被分離成兩條

3. 雜合雙鏈分析法(HA)
由突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成一個(gè)凸起,在非變性膠中電泳時(shí),會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈DNA不同的遷移率,從而使兩者被分離開(kāi)。該方法原理與單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)相似,只不過(guò)SS-CP分離的是單鏈,而HA法分離的是雙鏈。HA法簡(jiǎn)單迅速,但只適用于200～300pb的片段,且不能確定突變位置,檢出率只有80%左右,有人建議將HA法和SSCP法聯(lián)合使用,可能將檢出率提高到接近100%[4],也有科研工作者建議使用缺失的野生型等位基因來(lái)提高該方法的靈敏度

4. 化學(xué)切割錯(cuò)配(CCM)
化學(xué)切割錯(cuò)配是在Maxam-Gilbert測(cè)序的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)突變檢測(cè)技術(shù),在DNA∶DNA或DNA∶RNA異源雜合雙鏈核酸分子中,錯(cuò)配的C能被羥胺(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,錯(cuò)配的T能被四氧化鋨(Osmiumtetroxide)所切割,切割產(chǎn)物跑變性膠電泳即可確定是否存在突變。只要操作得當(dāng),不會(huì)發(fā)生非特異性切割,如果對(duì)正義鏈和反義鏈都進(jìn)行分析,可使檢出率達(dá)到100%;使用熒光檢測(cè)系統(tǒng)將會(huì)大大增強(qiáng)該方法的靈敏度,從而可檢測(cè)出十個(gè)細(xì)胞中的一個(gè)突變細(xì)胞[7]。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是能對(duì)長(zhǎng)至2kb的片段分析,并能確定突變位置,缺點(diǎn)是步驟多,費(fèi)時(shí),且需接觸有毒的化學(xué)物質(zhì)。

5.碳化二亞胺檢測(cè)(Carbodiimide,CDI)與CCM法相似,CDI能夠?qū)﹀e(cuò)配的G和T進(jìn)行修飾,當(dāng)用標(biāo)記的引物對(duì)CDI修飾過(guò)的雙鏈DNA進(jìn)行DNA合成時(shí),延伸會(huì)在修飾過(guò)的堿基處終止下來(lái),合成產(chǎn)物跑變性聚丙烯酰胺凝膠電泳即可檢測(cè)出是否有突變。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)也是能對(duì)1～2kb的片段進(jìn)行分析,突變檢出率達(dá)到100%,能確定突變位置,并且CDI是一種沒(méi)有毒性的物質(zhì),有報(bào)道曾用該法檢測(cè)出了7.2kbDNA片段中的一個(gè)點(diǎn)突變,但當(dāng)一個(gè)DNA片段中存在多個(gè)突變時(shí),該方法就不適用。

6.酶促切割錯(cuò)配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)　　
EMC是一種與RNaseA切割相類似的方法,T4核酸內(nèi)切酶 是一種分解酶(resolvase),能夠識(shí)別12種錯(cuò)配的堿基并在錯(cuò)配堿基的附近進(jìn)行切割,酶切產(chǎn)物跑變性膠或中性膠即可檢測(cè)出是否有突變[9],電泳產(chǎn)物的檢測(cè)可用放射自顯影,也可用銀染。由于該法能對(duì)DNA∶DNA異源雜合分子進(jìn)行分析,因而省去了體外轉(zhuǎn)錄的步驟,其最長(zhǎng)檢測(cè)片段可達(dá)到1.5kb,該法的缺點(diǎn)是存在非特異性切割現(xiàn)象,并且對(duì)有些錯(cuò)配堿基的識(shí)別不是100%,因此在每次檢測(cè)時(shí)都必須設(shè)有一個(gè)內(nèi)對(duì)照。

7.單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-StrandCon-formationalPolymorphism,SSCP)
該方法的原理是[10]:單鏈DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu),這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成,即使是一個(gè)堿基的不同,也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)并引起在非變性電泳條件不同的電泳遷移率

8.切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性
(CleavageFrag-mentLengthPolymorphismCFLP)CFLP技術(shù)是在限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RELP)和SSCP基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種基因突變檢測(cè)技術(shù),其原理是:雙鏈DNA變性后形成的單鏈在中性條件下形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(包含多個(gè)折疊的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)),正如SSCP一樣,這種二級(jí)結(jié)構(gòu)取決于DNA的核苷酸組成和順序,即使有一個(gè)堿基的差異,也會(huì)形成不同數(shù)目的折疊狀發(fā)夾結(jié)構(gòu),而CleavaseI外切酶能識(shí)別這種發(fā)夾結(jié)構(gòu),并在該結(jié)構(gòu)的附近進(jìn)行切割,切割產(chǎn)物跑變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè),突變的DNA將出現(xiàn)與正常對(duì)照不同的酶切圖譜

9.DNA測(cè)序(Sequencing)
由各種突變檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到的突變最后都得由測(cè)序來(lái)確定突變類型及突變位置,而且測(cè)序法檢測(cè)突變的效率達(dá)到100%,基于此,有科研工作者提出對(duì)一些比較小,外顯子比較少的基因的突變檢測(cè)直接用測(cè)序來(lái)進(jìn)行,如CMTX的CX32基因的突變分析[16],但該方法需要較多的勞力,且需接觸同位素,由PEABD公司推出的DNA自動(dòng)測(cè)序儀使用四色熒光標(biāo)記代替了原來(lái)手工測(cè)序的同位素標(biāo)記,并且測(cè)序和分析數(shù)據(jù)的時(shí)間也大大縮短,但缺點(diǎn)是花費(fèi)昂貴,所以對(duì)一些較大的,外顯子較多的基因不宜用測(cè)序法直接檢測(cè)突變,同時(shí)也不適用于臨床對(duì)大量的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),此外,測(cè)序也不能被當(dāng)成是突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)的存在等問(wèn)題使得很難通過(guò)一次測(cè)序獲得精確的數(shù)據(jù)。

10.雙脫氧指紋圖譜法(DideoxyFinger-printing,ddF)
由于SSCP檢測(cè)方法的靈敏度受到電泳溫度、PCR片段大小等因素的影響,而直接DNA測(cè)序的方法又費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢(qián),因此有研究工作者在實(shí)際應(yīng)用中將SSCP和Sanger雙脫氧測(cè)序法結(jié)合起來(lái)形成一種新的突變檢測(cè)方法,即ddF[16]。該方法的基因原理是:將PCR產(chǎn)物回收純化后用兩個(gè)引物分別做Sanger雙脫氧測(cè)序反應(yīng),但不同的是僅加入一種雙脫氧終止劑,反應(yīng)產(chǎn)物跑中性聚丙烯酰胺凝膠電泳如果確有突變的話,在病人的電泳圖譜上將會(huì)丟失或獲得一條帶或者至少有一條帶的遷移率會(huì)發(fā)生改變。在ddF方法中,DNA鏈的遷移率不僅取決于其二級(jí)結(jié)構(gòu),而且與其大小相關(guān),因而較SS-CP法更為靈敏。MartincicD等曾經(jīng)將SSCP法和ddF法進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)ddF能將10種已知的p53抑瘤基因突變?nèi)�部檢測(cè)出來(lái),而SSCP法只能檢測(cè)到10種突變中的6種。ddF法的靈敏度不受電泳溫度的影響,所能檢測(cè)到10種突變中的6種。ddF法的靈敏度不受電泳溫度的影響,所能檢測(cè)的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度也能達(dá)到近500bp,并且該法還能對(duì)突變位置進(jìn)行相對(duì)定位。該法的主要缺點(diǎn)是需要使用同位素,同時(shí)對(duì)回收的PCR產(chǎn)物純度要求較高,非特異的PCR產(chǎn)物將嚴(yán)重影響到最后結(jié)果的分析。

11.錯(cuò)配接合蛋白檢測(cè)
從Ecoli中分離的一種DNA錯(cuò)配接合蛋白能在異源雜合雙鏈DNA中的錯(cuò)配堿基處接合DNA,接合后的產(chǎn)物跑測(cè)序膠,可通過(guò)電泳遷移率的改變檢測(cè)是否有突變[17]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,可一次處理大量的樣品,但據(jù)報(bào)道這種DNA錯(cuò)配接合蛋白對(duì)單堿基錯(cuò)配的接合程度不如對(duì)幾個(gè)堿基錯(cuò)配的接合那么強(qiáng),并且這種蛋白對(duì)非錯(cuò)配區(qū)也有一定的結(jié)合從而導(dǎo)致背景增高,最近有研究工作者建議將幾種DNA錯(cuò)配接合蛋白聯(lián)合起來(lái)使用將會(huì)提高突變檢測(cè)的準(zhǔn)確率[18],但總的來(lái)說(shuō)該方法有待于進(jìn)一步發(fā)展。
13.變性的高效液相色譜檢測(cè)(DenaturingHighPerformanceLiguldChromatographyDHPLC)DHPLC技術(shù)是一項(xiàng)在SSCP和DGGE基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新的雜合雙鏈突變檢測(cè)技術(shù),其原理與DGE類似,即通過(guò)HPLC在部分變性的條件下可將發(fā)生錯(cuò)配的異源雜合雙鏈DNA和完全匹配的同源雙鏈DNA分離開(kāi)來(lái)[21]。DHPLC技術(shù)曾被用來(lái)進(jìn)行比較DNA測(cè)序[22],目前在Stanford的一個(gè)研究小組正在利用該技術(shù)檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因突變。與傳統(tǒng)的雜合雙鏈分析技術(shù)相比較,該技術(shù)花時(shí)短,分析一個(gè)樣品一般僅需5分鐘,不需使用放射性同位素,自動(dòng)化程度高,但是需要另處購(gòu)買(mǎi)一臺(tái)HPLC儀器。雖然目前該技術(shù)主要用來(lái)檢測(cè)200～300bp大小的DNA片段,長(zhǎng)的DNA片段的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道,但研究工作者對(duì)此持樂(lè)觀態(tài)度。

14.DNA芯片技術(shù)(DNAchip)
DNA芯片技術(shù)是90年代以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù),該技術(shù)結(jié)合了集成電路計(jì)算機(jī)、半導(dǎo)體、激光共聚集掃描,熒光標(biāo)記探針和寡核苷酸DNA合成等技術(shù),充分體現(xiàn)了生物學(xué)技術(shù)與其它重要的作用,如基因定位,DNA測(cè)序,物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等,同樣,在基因突變檢測(cè)方法,DNA芯片技術(shù)的前景也令人鼓舞,其基本原理是:許多已知順序的寡核苷酸DNA被排列在一塊集成電路板上,彼此之間重疊一個(gè)堿基,并覆蓋整個(gè)所需檢測(cè)的基因,熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA分別與兩塊DNA芯片雜交,由于至少存在一個(gè)堿基的差異,正常DNA和突變DNA將會(huì)得到不同的雜交圖譜,通過(guò)共聚焦顯微鏡分別檢測(cè)兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)即可確定是否存在突變。

15.等位基因特異性擴(kuò)增
16.等位基因特異性寡核苷酸片段分析(Allele-SpecificOligonucleotide,ASO)17.引物延伸檢測(cè)(PrimerExtension,PEX)PEX
18.寡核苷酸連接檢測(cè)(OligonucleotideLigationAssay,OLA)
19.限制性片段分析(RestrictionFragmentAnalysis)