氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結果，而必須由已知標準作對照定性。當無純物質對照時，定性鑒定就很困難，這時需借助質譜、紅外和化學法等配合。另外大多數金屬鹽類和熱穩定性差的物質還不能分析。此缺點可高效液相色譜法來克服。在經典液相色譜的基礎上，引入了氣相色譜的理論與技術，在70年代初建立了高效液相色譜分析法（以HPLC表示）。在常壓下操作的液相色譜，分離一個樣品往往長達幾小時至幾十小時，因此工作效率很低。人們曾對這種經典液相色譜法試用了柱前加壓或柱后減壓的辦法來提高流速，以縮短分離時間，但是結果失敗了。根據液相色譜理論，因為隨著載液（流動相）流速的提高，板高則增大，所以柱效會顯著降低。隨著生產技術的提高，人們制成了細小（<10μm）而高效的填充物，從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小，柱壓降顯著增大，為了得到合理的載液流速，使用了高壓；輸液泵，使流速達到1～10mL/min。從而使分析一個多組分樣品只需幾分鐘到幾十分鐘時間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器以及電子技術和計算機技術的應用，70年代以業逐步實現了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動化操作。因此人們常稱它為高效液相色譜或現代液相色譜，以區別于經典液相色譜。高效液相色譜法的分類與經典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類。

高效液相色譜所用基本概念：

保留值等色譜分析有關術語，以及分配系數、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動相，則速率議程H=A B/? C?。式中：縱向擴散項（分子擴散項）B/?對板高的影響與氣相色譜不同，由于液相色譜中組分分子在流動相中的擴散系數Dm僅為氣相色譜中的萬分之一，因此縱向擴散項對板高的影響可以忽略不計。于是影響液相色譜的主要因素是傳質項Cu。由圖14—可知，氣相色譜（GC）的流動相流速u增大時，板高H顯著增大（即柱效顯著降低），而液相色譜（LC）的流速增大時，板高增大不顯著（即柱效降低不顯著）。這說明高效液相色譜也有很高的分離效能，此外，氣相色譜的載氣權數種，其性質差別也不大，對分離效果影響也不大。而液相色譜的載液種類多，性質差別也大，對分離效果影響顯著。因此流動相的選擇很重要，并且在選擇流動相對應注意以下幾點：流動相對樣品有適當的溶解度，但不與樣品發生化學反應，也不與固定液互溶；流動相的純度要高（至少分析純）、粘度要小，以免帶進雜質和組分在流動相中擴散系數下降；流動相應與所用檢測器相匹配，不應對組分檢測產生干擾作用。高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點，還由于它的流動相（載液）種類比氣相色譜的流動相（載氣）多，因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動相，從機時可提高選擇性。此外，液相色譜的餾分比氣相色譜易于收集。便于為紅外、核磁等方法確定化合物結構提供純樣品。由于高效液相色譜法具有以上特點，它適于分離、分析沸點高、熱穩定性差、分子量大（大于400）的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機物和一些無機物，而這些物質占化合物總數的75～80%。因此它已廣泛用于核酸、蛋白質、氨基酸、維生素、糖類、脂類、甾類化合物、激素、生物堿、稠環芳烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機化合物以及多種無機鹽類的分離和分析。但是，高效液相色譜的固定相的分離效率、檢測器的檢測范圍以及靈敏度等方面，目前還不如氣相色譜法。此外對于氣體和易揮發物質的分析方面也遠不如氣相色譜法，因此高效液相色譜法和氣相色譜法配合使用可互相取長補短，相輔相成。

1.分離原理
凝膠色譜，又稱空間排阻色譜。它是利用某些凝膠對混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進行分離、分析的方法。凝膠色譜的分離要理和其它色譜法不同，它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。色譜柱內填充具有一定大小孔穴的凝膠。當樣品進入色譜柱后，不同大小的樣品分子（圖14—2中以黑點表示）隨流動相沿凝膠顆粒（圖14—2中以空心圈表示）外部間隙和凝膠孔穴旁流過，體積在的分子因不能滲透到凝膠孔穴里而得到排阻，因此較為順利地通過凝膠柱而較早地被流動相沖洗出來。中等體積的分子產生部分滲透作用，小分子可滲透到凝膠孔穴里去而受阻滯，因有一個平衡過程而較晚地被流動相沖洗出來。這樣，試樣組分基本上按分子大小受到不同阻滯而先后流出色譜柱，從而實現分離目的。光凝膠色譜采用水溶液作流動相進，稱為過濾凝膠色譜（HFC），而用有機溶劑為流動相時，稱為凝膠滲透色譜（GPC）。

2．固定相
凝膠色譜的固定相凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質，是一種經過交聯而具有立柱網狀結構的多聚體。根據凝膠的交聯程度和含水量的不同，分了軟質、半硬質和硬質三種。軟質凝膠（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）交聯度低，膨脹度大，容量大，可壓宿，不能用于高壓（使用壓力低于3.5kg/㎝2或更低），主要用于含水體系的常壓凝膠色譜，半硬質凝膠（如苯乙烯一二乙烯基苯交聯共聚凝膠），容量中等，滲透性較高，壓力可用到70kg/㎝2。適用于非水溶劑流動相；硬質凝膠（如多孔硅膠、多也玻球等），膨脹度小，不可壓縮，滲透性好，可耐高壓，適于高流速下操作。

3．流動相
在凝膠色譜中，為提高分率效率，多采用低粘度、與樣品折光指數相差大的流動相。常用的流動相有苯、甲苯、鄰二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。