生物樣品往往是非常復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)，必須將樣品進(jìn)行生物處理。從血液或活組織中獲取的DNA/mRNA樣品在標(biāo)記成為探針以前必須擴增以提高閱讀靈敏度，但這一過程操作起來卻有一定的難度。比如在一個癌細(xì)胞中有成千上萬個正常基因的干擾，雜合癌基因的檢測和對它的高效、特異地擴增就不是一件容易的事。因為在一般溶液中PCR擴增時，靶片段太少且不易被凝膠分離，故存在其它不同的DNA片段與其競爭引物的情況。美國Mosaic Technology公司發(fā)展了一種固相PCR系統(tǒng)。此系統(tǒng)包含兩套引物，每套都可以從靶基因兩頭延伸。當(dāng)引物和DNA樣品及PCR試劑相混時，如果樣品包含靶序列，DNA就從引物兩頭開始合成，并在引物之間形成雙鏈DNA環(huán)或"橋"。由于上述反應(yīng)在固相中產(chǎn)生，因而避免了引物競爭現(xiàn)象，并可減少殘留物污染和重復(fù)引發(fā)。

　　根據(jù)樣品來源、基因含量、檢測方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴增及標(biāo)記方法各異。為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記方法有熒光標(biāo)記法、生物素標(biāo)記法、同位素標(biāo)記法等。目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不同來源樣品的平行分析。

　　樣品制備的常用試劑：對于檢測表達(dá)的芯片，樣品制備通常涉及（m）RNA的純化，cDNA的合成，體外轉(zhuǎn)錄或者PCR，標(biāo)記等步驟。而對于SNP或者突變檢測，則往往涉及Genomic DNA純化和PCR、標(biāo)記等步驟。

　　1. RNA純化：

　　從樣品中分離純化高質(zhì)量的RNA是非常重要的第一步。由于RNA樣品中的DNA碎片會影響后繼的PCR反應(yīng)，所以要徹底除去樣品中的DNA。通常用mRNA純化的方法可以除去DNA片斷，或者用RNase-Free的DNase處理RNA樣品。在這里我們介紹一些常用的RNA純化試劑盒，特別是由Affymetrix公司推薦的QIAGEN RNA純化系列。

　　* RNeasy Protect Kit：

　　一旦生物樣品被收集分離，它的RNA會立刻變得非常不穩(wěn)定，極易被降解。由于特異及非特異的RNA降解，或者由于應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生新的RNA都會引起RNA狀態(tài)的改變。對于生物芯片、基因表達(dá)矩陣分析（Array Analysis）、定量RT-PCR等實驗來說，采樣后立即穩(wěn)定樣品里的RNA以保存當(dāng)時RNA的表達(dá)狀態(tài)，是精確/定量研究基因表達(dá)分析的重要前提。為了達(dá)到這個目的，往往需要將液氮或者干冰帶到采樣現(xiàn)場，采樣后立即抽提RNA或者運回實驗室保存。對于實驗者來說非常不方便。

　　著名的QIAGEN公司最近新推出一種RNA抽提試劑：RNeasy Protect Kit，提供一整套RNA保護(hù)和分離試劑，從樣品的制備到RNA的抽提，只需一個試劑盒即可解決所有問題。保證樣品的表達(dá)信息不受破壞，確保得到可信的基因表達(dá)分析結(jié)果。

　　試劑盒里提供一種RNAlater RNA Stabilization Reagent，只要在采樣后立即將新鮮樣品浸入這種液體試劑，RNA保護(hù)劑可以迅速滲透到組織或其他生物樣本中，穩(wěn)定并保護(hù)RNA完整而不被降解，確保下游分析得到的數(shù)據(jù)真實反應(yīng)樣品的表達(dá)信息。保存在RNAlater中的樣品RNA可以在37度下穩(wěn)定保存1天，或者在18-25度保存7天，2-8度穩(wěn)定4周，或者在-20度永久保存。這種技術(shù)為在不同溫度下采樣，運輸和保存樣品提供了極大的方便，特別適用于各種動物組織、培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌、白細(xì)胞，但必須說明的是它不適用于全血或體液中RNA的保存。

　　RNAlater的用法非常簡單，只要在采樣后立即將樣品完全浸入適量（10ul/1mg組織）的RNAlater中即可。取樣的動作要盡量快速利索，組織樣品的大小以不超過0.5公分厚為宜，對于一些小的組織如小鼠的脾、腎等器官則可以整個取出浸入溶液中，較大的則應(yīng)切開為厚度小于0.5公分的小塊，以確保RNAlater 能迅速擴散滲透入組織塊中的所有細(xì)胞中。采樣的容器應(yīng)該足夠大以容納10倍于組織重量的溶液，避免組織塊擠在一起，同時建議將溶液加滿容器以避免在運輸過程中組織塊露出液面。注意本試劑只適用于新鮮樣品，對于冷藏和包埋的樣品直接抽提RNA即可。另外對于RNA已經(jīng)降解的樣品，RNAlater只能保護(hù)剩下的樣品RNA，不能修復(fù)已破壞的RNA。

　　保存后的樣品可以直接用于RNA或者mRNA的抽提。RNAlater不會影響組織塊的結(jié)構(gòu)，可以在室溫下切出適量的組織塊用于稱量和抽提RNA，剩下的部分可用于繼續(xù)保存樣品。-20度凍存的樣品可以取出在室溫下進(jìn)行稱量等操作而無需干冰。在-20度凍存的樣品反復(fù)凍融20次RNA依然保持完好無損。RNAlater處理的樣品比新鮮組織稍微硬一點，但不會影響勻漿過程。取出適量的樣品即可開始加RLT緩沖液進(jìn)行勻漿化。

　　和傳統(tǒng)的RNeasy Kit一樣，RNeasy Protect Kits采用QIAGEN著名的硅膠膜純化柱技術(shù)，迅速特異地吸附樣品裂解液中的RNA，無需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超離，只要洗脫即可得到純的RNA。通常情況下RNeasy的純化技術(shù)足以除去絕大部分的DNA，而無需額外進(jìn)行DNaes處理，但是對于一些對痕量DNA非常敏感的實驗，用RNase-Free DNase Set（QIAGEN cat.no. 79254）可以直接在純化柱上消化DNA殘留，在隨后的洗滌步驟中除去DNase，最后洗脫得到不含DNA的純RNA。

　　試劑盒具有以下優(yōu)點：

　　·迅速穩(wěn)定并保護(hù)RNA，確保基因完整、基因表達(dá)信息可靠。

　　·由于RNA Stabilization試劑，您可以放心地在室溫下操作，方便、安全--無須液氮和干冰。

　　·確保RNA不受降解--即使多次凍溶也不受影響。

　　·簡單、快速和可靠RNA分離--使用于所有下游分析的即用型RNA。

　　貨號 品名（規(guī)格） 價格（RMB）

　　74124 RNeasy Protect Mini Kit(50) 3181.00

　　75152 RNeasy Protect Midi Kit(10) 1313.00

　　75182 RNeasy Protect Maxi Kit(12) 4140.00

　　76104 RNAlater RNA Stabilizationeagent 682.00

　　* QIAGEN RNeasy Total RNA純化系列（Affymetrix推薦！）

　　采用QIAGEN著名的硅膠膜純化柱技術(shù)，迅速特異地吸附樣品裂解液中的RNA，無需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超離，只要20分鐘（Mini Kit）到1小時（Maxi Kit）即可直接從樣品中提取高質(zhì)量的Total RNA。以下是部分產(chǎn)品信息，更大的包裝信息或者詳細(xì)操作手冊歡迎致電基因有限公司或者點擊產(chǎn)品名稱查看。

　　貨號 品名（規(guī)格） 價格（RMB）

　　74104 RNeasy Mini Kit (50)

　　75142 RNeasy Midi Kit (10)*

　　75162 RNeasy Maxi Kit (12)*

　　74903 RNeasy Plant Mini Kit (20)

　　* QIAGEN Oligotex Direct mRNA純化系列 （Affymetrix推薦！）

　　Direct系列產(chǎn)品無需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超離，不到30分鐘可直接從樣品中純化出高質(zhì)量的mRNA，可用于各種常規(guī)應(yīng)用以及芯片分析，顯微注射，建庫，消減雜交，SAGE技術(shù)等要求很高的的實驗。回收率高達(dá)90%以上。以下是部分產(chǎn)品信息，更大的包裝信息或者詳細(xì)操作手冊歡迎致電基因有限公司或者 到生物通商城查詢。

　　貨號 品名（規(guī)格） 價格（RMB）

　　72012 Oligotex Direct mRNA Micro Kit

　　72022 Oligotex Direct mRNA Mini Kit

　　72041 Oligotex Direct mRNA Midi/Maxi Kit

　　70022 Oligotex mRNA Mini Kit

　　70042 Oligotex mRNA Midi Kit

　　70061 Oligotex mRNA Maxi Kit

　　* QIAamp RNA Blood Mini Kit

　　專為從新鮮全血中快速提取高質(zhì)量的RNA而設(shè)計，專利設(shè)計的QIAshredder和QIAamp離心純化柱讓你徹底擺脫酚氯仿抽提和離心沉淀的苦惱，簡便快速地純化出適用于各種用途的優(yōu)質(zhì)RNA。 QIAamp Viral RNA Mini Kit則適用于從各種無細(xì)胞的體液、血清、尿液、CSF中分離RNA，回收率高達(dá)90%以上。

　　貨號 品名（規(guī)格） 價格（RMB）

　　52304 QIAamp RNA Blood Mini Kit(50)

　　52904 QIAamp Viral RNA Mini Kit (50)

　　* Clontech公司的Atlas Glass Total RNA Isolation Kit是專為Clontech公司的Atlas Glass

　　Microarray設(shè)計的RNA純化試劑盒。由于Clontech公司認(rèn)為離心柱式的RNA純化系統(tǒng)純化的樣品RNA在制備探針會在Atlas Glass Microarray上有較高的背景，因而特別設(shè)計用硫氰酸胍/酚抽提制備適用于Atlas Glass Microarray樣品RNA以便進(jìn)行下一步的熒光/同位素標(biāo)記。

　　2. Genomic DNA的分離純化：

　　對于Genotyping、SNP分析和Genomic Chip來說，要檢測基因組或者染色體上的突變就需要制備樣品的基因組DNA而非RNA以進(jìn)行檢測。在這里簡單介紹幾個常用的試劑盒，有關(guān)詳細(xì)資料和操作手冊歡迎致電基因有限公司或到生物通商城查詢。

　　* QIAamp System（Affymetrix推薦！）

　　QIAGEN公司專利的樣品純化技術(shù)方便快速從多種臨床樣品中純化高質(zhì)量的Genomic DNA，無需酚氯仿抽提和乙醇沉淀。根據(jù)不同的樣品來源可以選擇特定的試劑盒。

　　貨號 品名（規(guī)格） 價格（RMB）

　　51104 QIAamp DNA Blood Mini Kit(50)

　　51183 QIAamp DNA Blood Midi Kit(20)

　　51192 QIAamp DNA Blood Maxi Kit(10)

　　51304 QIAamp DNA Mini Kit(50)

　　51504 QIAamp DNA Stool Mini Kit(50)

　　DNeasy System 是QIAGEN公司為除臨床樣本以外的其他樣本，如動物組織、血液、酵母、細(xì)菌、植物等快速制備基因組DNA而設(shè)計的，采用硅膠膜技術(shù)，無需酚氯仿抽提和乙醇沉淀。單個離心柱或96孔純化板滿足不同的需求。 歡迎直接到生物通商城查詢更多有關(guān)產(chǎn)品的信息.

　　貨號 品名（規(guī)格） 價格（RMB）

　　69504 DNeasy Tissue Kit(50)

　　69103 DNeasy Plant Mini Kit(20)

　　69104 DNeasy Plant Mini Kit(50)

　　68161 DNeasy Plant Maxi Kit(6)

　　3. 探針的制備和標(biāo)記：

　　對于表達(dá)芯片分析，常用的有以下幾種方法制備和標(biāo)記探針：將純化的樣品RNA通過特定的引物逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA探針，在合成的過程中摻入標(biāo)記物；或者先將待測樣品的RNA轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)一步通過加入標(biāo)記物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA單鏈探針，又或者將合成的cDNA加標(biāo)記物和特殊引物進(jìn)行PCR擴增，制備成標(biāo)記的雙鏈探針。而對于SNP芯片和突變檢測，則需要將純化的基因組DNA用特定的引物擴增并進(jìn)行標(biāo)記。由于不同的DNA Array供應(yīng)商對于標(biāo)記有不同的要求，我們在下面分別介紹。

　　1）Affymetrix的表達(dá)芯片：

　　要求制備樣品的cRNA探針。為保證制備出足夠的cRNA用于雜交和每一步的樣品分析，Affymetrix公司推薦用1μg以上的mRNA（最少0.2μg以上）或者5μg以上的總RNA開始合成cDNA。以HPLC純的T7-(dT)24 Primer(推薦選用GENSET公司的產(chǎn)品，要求是HPLC純的，PAGE膠純化的引物在這里不適用)作為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA。由于引物中帶有T7序列，因此合成的cDNA的3'端也帶有T7序列。選用Affymetrix公司提供的Enzo？ BioArray？ HighYield？ RNA Transcript Labeling Kit(Cat.No.900182,10次標(biāo)記)，通過試劑盒提供的生物素標(biāo)記的核糖核酸和T7 RNA聚合酶，以體外轉(zhuǎn)錄（IVT）的方式擴增并標(biāo)記cRNA探針。試劑盒提供體外轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記的所有試劑，可以作10個反應(yīng)。標(biāo)記好的探針經(jīng)過隨機片斷化（fragmentation，試劑自行配制）后得到大小約為35-200個堿基大小的RNA片斷即可和芯片進(jìn)行雜交。

　　2）Affymetrix公司的Genotyping（如人類SNP圖譜分析芯片）和健康研究芯片：

　　這一類芯片用于檢測樣品基因組的變異，因而只需純化基因組DNA，并用配套的Primer進(jìn)行PCR擴增。HuSNP的配套試劑盒里還提供標(biāo)記好的引物。而對應(yīng)2種健康研究芯片，Affymetrix公司則提供Enzo？ BioArray？ Terminal Labeling Kit進(jìn)行末端熒光標(biāo)記。

　　3） Clontech公司的Atlas Pure Total RNA Labeling System：

　　這是一個從Total RNA中制備同位素標(biāo)記的cDNA探針的試劑盒。利用生物素偶聯(lián)的Oligo（dT）和磁珠偶聯(lián)的Streptavidin將mRNA吸附到磁珠上，加入MacroArray（包括尼龍膜基質(zhì)和塑料基質(zhì)）提供的基因特異引物混合物（CDS Primer）、同位素標(biāo)記物和逆轉(zhuǎn)錄酶，直接在磁珠上合成同位素標(biāo)記的cDNA探針，最后從磁珠上洗脫標(biāo)記好的探針，純化后即可用于雜交。這個標(biāo)記試劑盒可以從少至10μg的total RNA中制備適用于Clontech公司各種尼龍膜基質(zhì)和塑料基質(zhì)MacroArray的高質(zhì)量cDNA探針。由于將mRNA純化和cDNA探針合成、標(biāo)記合為一體，方便用戶的同時還可節(jié)約成本。這個系統(tǒng)不適用于玻片芯片的探針標(biāo)記。

　　4） Clontech公司的SpotLight Chemiluminescent System

　　這種專為Clontech公司各種尼龍膜基質(zhì)的Macroarray設(shè)計的化學(xué)發(fā)光試劑盒助你徹底從同位素中解放出來，讓你輕松快速、高靈敏度地進(jìn)行各種尼龍膜基質(zhì)的雜交印跡和MacroArray的非放射性檢測。兩種標(biāo)記試劑盒（Atlas SpotLight Labeling Kit和SpotLight Random Primer Labeling Kit）適應(yīng)不同的研究需要，配合通用的雜交檢測試劑盒（SpotLight Chemiluminescent Hybridization & Detection Kit），即可組合出完整的非放射性檢測分析系統(tǒng)。不過這個系統(tǒng)不適用于玻片基質(zhì)的芯片的探針標(biāo)記。

　　由于Atlas系列的DNA微陣列膜上每個點的核酸量有限，所以對標(biāo)記探針的靈敏度要求非常高，一般情況下同位素是首選。如今Atlas SpotLight標(biāo)記試劑盒特別提供逆轉(zhuǎn)錄所需的試劑，可以將2μg以上的mRNA或者50μg以上的RNA樣品制備成生物素標(biāo)記的單鏈cDNA探針，由于沒有競爭性抑制，單鏈探針的靈敏度要大大高于雙鏈探針。另外生物素標(biāo)記的探針比32P標(biāo)記的探針要穩(wěn)定，可以在半年內(nèi)多次重復(fù)使用。

　　對于Southern、Northern和多組織Northern預(yù)制雜交膜（MTN）、多組織表達(dá)矩陣（MTE）等以尼龍膜為基質(zhì)的雜交、印跡反應(yīng)，可以選用SpotLight隨機引物標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，和同位素標(biāo)記一樣簡單，但卻更加安全、容易處理，而且生物素標(biāo)記的探針穩(wěn)定時間更長。

　　配套通用的雜交檢測試劑盒里提供特殊配方的SpotHyb雜交液，能有效降低背景，減少非特異雜交，提高靈敏度。HRP偶聯(lián)的Streptavidin能高效專一地結(jié)合生物素標(biāo)的探針。采用了加強型的化學(xué)發(fā)光試劑，信號強且發(fā)光信號可以持續(xù)6小時之久，通常壓片5-10分鐘，一旦結(jié)果不理想，允許反復(fù)壓片。相比同位素需要壓片過夜，SpotLight讓你當(dāng)天就得到實驗結(jié)果，可謂安全、方便、快速多了；而相比常規(guī)化學(xué)顯色法，SpotlLight化學(xué)發(fā)光法的靈敏度要高的多，信號更清晰、干凈，而且不會出現(xiàn)一旦顯色過度就不可逆轉(zhuǎn)的毛病。

　　5) Clontech Atlas Glass Fluorescent Labeling Kit

　　這是一個間接熒光探針標(biāo)記試劑盒，標(biāo)記好的熒光探針適用于各種玻片基質(zhì)的DNA芯片。在試劑盒提供的dNTP Mix中以氨基化的dUTP（Aminoallyl-dUTP）代替普通的dUTP（這種修飾不影響合成效率），加入2μg以上的樣品mRNA或者20μg以上的total RNA，以及基因特異性引物（一般由芯片試劑盒提供）和逆轉(zhuǎn)錄酶，合成氨基修飾的cDNA。這時只要加入N-羥琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide）活化的熒光染料（自備）進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，熒光染料的活化基團就會和cDNA中的修飾dUTP上的氨基偶聯(lián)，從而生成熒光標(biāo)記的cDNA探針。熒光染料可以是Cy3、Cy5、FITC、fluorescein、Texas red、rhodamine、bodipy或者Alexa dye，而且各種熒光染料的標(biāo)記效率相當(dāng)。值得一提的是這種間接熒光標(biāo)記比直接標(biāo)記法的效率更高，在雙色熒光標(biāo)記時，可以避免直標(biāo)法因為Cy5標(biāo)記效率低而導(dǎo)致Cy3、Cy5兩種顏色信號強度不同的現(xiàn)象。試劑盒提供除熒光染料外的全部試劑，足夠作10次標(biāo)記。

　　6）Vysis公司的Microarray Nick Translation Kit是配合Vysis公司的Genomic Microarray--AmpliOnc I Microarray的熒光標(biāo)記試劑盒，采用缺口平移的方法將熒光標(biāo)記的dUTP摻入純化的樣品基因組DNA中作為探針，和AmpliOnc I Microarray進(jìn)行雜交。

　　除了廠家為自家的DNA Array提供的配套核酸純化和標(biāo)記試劑盒,我們還介紹幾個比較有特色的同類產(chǎn)品：

　　4．用于多次反復(fù)雜交的可洗脫探針制備技術(shù)：

　　Ambion公司的Strip-EZ RT Kit是專門為尼龍膜基質(zhì)的Macroarray，以及各種預(yù)制雜交膜而設(shè)計的cDNA探針合成標(biāo)記試劑盒。我們在前面介紹過尼龍膜基質(zhì)或者塑料基質(zhì)的Macroarray的優(yōu)點之一是在雜交檢測后可以將膜上結(jié)合的探針洗脫，因而膜可以重復(fù)使用多次，能夠一定程度的降低每一次的使用成本。常規(guī)的膜再生方法需將膜放在SDS溶液中煮沸一定時間，因而會對膜和膜上的信號造成損耗，通常重復(fù)使用3次后已經(jīng)得不到清晰的信號。

　　Strip-EZ RT試劑盒的工作原理是在逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA探針的同時摻入經(jīng)修飾過的脫氧核苷酸（專利技術(shù)，這種修飾不會影響探針的雜交特性）和標(biāo)記核苷酸，合成的探針與膜經(jīng)過雜交、檢測后將膜浸入Probe Degradation Buffer中5分鐘，修飾過的脫氧核苷酸降解，探針即被降解寡核苷酸碎片，再將膜浸入再生Buffer中68℃下溫和地洗脫降解的寡核苷酸碎片，膜即可再生。Strip-EZ RT Kit制備的cDNA探針可以在非常溫和的條件下（試劑由試劑盒提供）洗脫原有的雜交信號，減輕對膜的傷害，延長膜的使用壽命，降低膜的使用成本。數(shù)據(jù)表明經(jīng)過9-15次反復(fù)洗脫后的膜依然能得到清晰的雜交信號(見圖，左邊為STRIP-EZ標(biāo)記探針，右邊為普通探針，膜經(jīng)過1，3，5，10，15輪反復(fù)雜交-洗脫-再雜交后檢測信號）這個試劑盒可用于同位素標(biāo)記和非放射性標(biāo)記，需要0.5-1μg以上的mRNA或者10μg以上的total RNA作為起始材料，不過廠家推薦盡可能的使用純化的mRNA，因為使用total RNA會導(dǎo)致較高的非特異背景，影響檢測。

　　Ambion公司針對不同廠家的Macroarray還推出了優(yōu)化條件的專用試劑盒Array-Advantage AA Kit （Cat.No. 1857，for Clontech's Atlas Nylon Array)， Array-Advantage GF Kit (Cat.No. 1855, for Research Genetics' GeneFilters Array， Array-Advantage UA Kit （Cat.No.1853, for Ambion's ULTRArray)。除了Strip-EZ RT所需試劑外，這種試劑盒里還提供探針純化柱（30），可以除去探針中多余的標(biāo)記物和雜質(zhì)，同時還提供適用于尼龍膜的快速雜交液（500ml）、20xSSC（1L）、10%SDS（1L）等試劑和需要用到的指管。對于需要RNA探針或者DNA探針的用戶，Strip EZ還有RNA、DNA和PCR三種不同的試劑盒可供選擇，詳情請致電基因有限公司或訪問生物通商城。

　　以上各種方法都要求較大量的起始材料（通常要1μg以上的mRNA），對于那些數(shù)量很少的樣品該怎么辦呢？對于細(xì)胞數(shù)量不少于1000或者質(zhì)量不少于100μg的樣品，可以選用Clontech公司的SMART PCR cDNA Synthesis Kit（K1052—1）結(jié)合Atlas SMART Probe Amplification Kit。SMART技術(shù)是利用逆轉(zhuǎn)錄酶在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程中遇到mRNA5’端帽子結(jié)構(gòu)時會自動加若干個dCTP的特性，在反應(yīng)體系中加入末端帶若干個G的SMART Oligonucleotide與之形成匹配，使逆轉(zhuǎn)錄酶以SMART引物為模板繼續(xù)延伸合成的cDNA，從而使合成的cDNA5’端帶上SMART引物的對應(yīng)序列，就可以直接用PCR進(jìn)行擴增。因此只要少至50ng的total RNA就可以通過擴增得到足夠的材料來合成探針。擴增后的cDNA加入基因特異性引物（如果沒有，可以用隨機引物，但會導(dǎo)致背景升高和靈敏度降低）、Klenow酶、SMART Blocking Solution和標(biāo)記物合成cDNA探針。這個SMART Blocking Solution可以阻斷前面的SMART引物，避免對后繼的探針合成和雜交產(chǎn)生影響。SMART技術(shù)經(jīng)過優(yōu)化后可以保證擴增后的cDNA基本保持原始RNA樣品的復(fù)雜度和相對豐度，因而合成的探針也保持同樣的代表性。

　　對于更少的樣品，比如用Laser Capture Nicrodissection激光顯微俘獲系統(tǒng)從組織切片上挑選的少量細(xì)胞或者手術(shù)切下的較小的組織塊（例如活組織檢查切片），則可以考慮以下方法：用帶有T7序列的Oligo（dT）和特別靈敏的QIAGEN Sensiscript RT Kit（適用于特別少量的RNA樣品，如單細(xì)胞RT-PCR）將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為帶T7序列的cDNA，再用Ambion公司的MEGAscript High Yield Transcription Kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，大量擴增mRNA后再用不同的方法制備探針。Ambion公司專利的大規(guī)模合成RNA技術(shù)可以在較短時間內(nèi)合成大量RNA，其產(chǎn)量為常規(guī)方法的10—50倍，最長可以合成常達(dá)16kb的轉(zhuǎn)錄本，特別適合少量樣品中低豐度的RNA擴增。另外也可以選擇Ambion公司的Cell-to-cDNA試劑盒，則可以避免少量樣品抽提RNA的麻煩，通過細(xì)胞裂解、RNAse失活和DNAse消化到cDNA合成，直接合成cDNA，然后再配合MEGAscript High Yield Transcription Kit擴增RNA，最后標(biāo)記探針。

　　另外，由于標(biāo)記后需要去除標(biāo)記反應(yīng)中的雜質(zhì)和未摻入的標(biāo)記物才能進(jìn)行雜交，我們在這里另外介紹幾個純化探針的產(chǎn)品：

　　QIAGEN公司的QIAquick Nucleotide Removal Kit（Cat.No.28304, 50preps）獨特的硅膠膜技術(shù)能夠在5分鐘內(nèi)純化10μg從17mer—40mer的單鏈DNA或者40bp—10kb的雙鏈DNA，能去除99%以上的<10mer的寡核苷酸或者dNTP。特別適合去除同位素標(biāo)記反應(yīng)中的未摻入的標(biāo)記物。

　　Ambion公司的NucAway Spin Columns（Cat.No.10070，30preps）一步離心即可有效去除未摻入的標(biāo)記物和鹽，特別適合探針純化，保證無RNase、DNase污染。

　　Clontech公司的CHROMA SPIN olumn（Affymetrix推薦！）是一類預(yù)裝微型凝膠過濾柱，用時只要拆開兩端密封，離心--上樣--離心，即可有效去除樣品中的小分子雜質(zhì)，3種不同的緩沖液適合不同需要：TE Buffer適合常規(guī)的DNA純化，STE（TE 0.1M NaCl）適合需要較高鹽濃度以防止樣品分子間的離子相互作用，而DEPC-H2O（ 0.1M EDTA）適合RNA的純化。每一種緩沖液均有6種不同的型號，根據(jù)凝膠孔徑的不同，分離樣品的范圍可從15mer到Genomic DNA。

　　另外，有的研究人員習(xí)慣用酚氯仿抽提純化核酸，除了對人體有害，酚氯仿抽提的另一個問題是：為避免將中間層的蛋白雜質(zhì)或有機相連同上清一起吸出，往往需要棄去一部分上清不要，這種情況會造成相當(dāng)一部分樣品損失，特別是小體積的酚抽提。所以我們在這里介紹一個新產(chǎn)品，相信大家一定會喜歡：Eppendorf公司的Phase Lock Gel（Affymetrix推薦！）只要將酚氯仿和樣品的混合物加入預(yù)裝有Phase Lock Gel的管子里，離心，這種專利的化合物就會在水相和有機相之間形成一層致密的固體，將中間層的蛋白雜質(zhì)和下層有機相完全鎖在固體之下，你可以輕松的吸出全部水相樣品，提高回收率而不用擔(dān)心混入雜質(zhì)，也不用擔(dān)心酚氯仿會不小心流出來。對于大體積的樣品抽提，還可以直接將全部水相倒出而有機相依然被牢牢“鎖定”在管底不會流出。Phase Lock Gel不會影響常規(guī)的酶反應(yīng)，你可以在裝有Phase Lock Gel的管子里進(jìn)行酶切，加熱失活，再進(jìn)行酚抽，離心后酚被鎖在固相之下，再直接加入酚氯仿抽提，再離心，Phase Lock Gel會重新在新的水相和有機相之間形成固體，將全部有機溶液鎖在固體層之下，相當(dāng)方便。Phase Lock Gel分為PLG Heavy和PLG Light兩種，前者適用于堿法提質(zhì)粒、RNA抽提等雜質(zhì)較多（粘稠）的情況（不適合純酚抽提），后者適用于酶切反應(yīng)、cDNA合成、標(biāo)記反應(yīng)和常規(guī)組織Genomic DNA純化（Mouse tail除外），適用于純酚、酚氯仿、氯仿抽提。