摘要

　　制作芯片和獲得芯片的數(shù)據(jù)有許多不同的方法。這里我們介紹了在學(xué)術(shù)領(lǐng)域中兩種芯片的構(gòu)建和使用。除了詳細說明了技術(shù)細節(jié)外，我們還對組成和方法的優(yōu)缺點進行了評論，同時還介紹了雜交的方法。用我們所建立和使用芯片的方法來回答生物領(lǐng)域問題的事實證明了這種技術(shù)在大學(xué)的環(huán)境下是可行的。

　　一種獲得基因功能信息的高通量的方法是cDNA芯片。在一塊顯微鏡載玻片上包含了幾百至幾千個固定的DNA樣本，以類似于Northern blot 和 Southern blot的方法進行雜交。了解了這個方法后，我們決定在我們各自的實驗室Pennsylvania大學(xué)（Penn）和Albert Einstein學(xué)院醫(yī)學(xué)部（AECOM）制作了高速，高精度的芯片。這個設(shè)備是由Stanford醫(yī)學(xué)院Pat Brown制造的，第一次論證了這個方法的可行性。我們的目標(biāo)是（1）最終以合理的價格，用一塊或幾塊芯片來檢測哺乳動物細胞中每個基因的表達，（2）發(fā)展以芯片為基礎(chǔ)的繪圖方法，（3）兼顧硬件和超作方法，盡可能地提高靈敏度。

　　玻片的優(yōu)勢

　　一個理想化的支持物允許探針有效地固定在其表面，探針與目標(biāo)分子能牢固地雜交結(jié)合。與另一種用于制作芯片的標(biāo)準(zhǔn)支持物尼龍一樣，玻璃有許多的優(yōu)點。它也有其特長。首先，DNA樣品以共價鍵的形式結(jié)合在處理過的玻片上。第二，玻璃是一種耐用的材料，能夠耐高溫和高離子強度溶液的洗滌。第三，玻璃不是多孔材料，使雜交的容量能保持在最小，因此能提高探針與目標(biāo)分子的退火效率。第四，由于材料的低熒光性，不會有背景的影響。最后，兩種不同的探針能夠標(biāo)上兩種不同的熒光標(biāo)記，在一片芯片上同一個反應(yīng)中同時孵育；尼龍就受到連續(xù)或平行雜交的限制。

　　芯片需要大量的探針固定（或排列）在玻片上，這里我們描述了AECOM芯片，掃描儀以及進行了關(guān)于設(shè)計和操作的討論。如果想得到關(guān)于Penn芯片的信息，請到http://w95vcl.neuro.chop.edu/vcheung查找。

　　自動化裝置性質(zhì)

　　AECOM點樣儀，Albert，產(chǎn)生高密度的分隔的矩陣，矩陣包括cDNA、基因組DNA或其他類似的生物物質(zhì)。機械的基本組成有計算機控制的三軸向的機械手和獨特筆尖裝置。

　　設(shè)計特點

　　機械手被設(shè)計成能自動從96或384孔的微量滴定板中選取樣本，12支點樣筆同時升起，每個點樣筆收集了250-500nl溶液，在每塊玻片上放置0.25-1nl，產(chǎn)生的點的大小范圍直徑為100-150μm。機械手是由設(shè)置好的程序控制的，能進行連續(xù)的點樣，每一點避免與相鄰的點接觸，每點的中心距離大約為200-250μm。檢測的精密度大約是10μm。機械手放置在可視工作平臺上（Newport公司），允許放置大量的顯微鏡玻片，微量滴定板，三個洗滌裝置和一個干燥裝置。

　　洗滌裝置是個固定的容器，裝有蒸餾水，兩次微量滴定板使用后需要更換。當(dāng)筆尖浸過液體后，機械手要來回搖動點樣筆（大約5Hz）來增加清潔程度。雖然我們認為沒必要，但電腦控制的洗滌液可用超聲波或流動的水來替代。干燥裝置實際上是干/濕真空吸塵器（Sear公司，美國），接頭與插入筆尖的限制插口相匹配。干燥器要做到在筆尖有快速流動的空氣圍繞，保持局部真空。

　　所設(shè)計的機械手的重要目的是要達到在最小的震動范圍內(nèi)的高速和高精確性。我們使用了保濕的可視工作平臺，精密螺旋驅(qū)動地機械滑動，高分辨率的解碼器的隨動系統(tǒng)和沿著x軸方向的兩側(cè)支桿，避免了在一些系統(tǒng)中所見的懸臂結(jié)構(gòu)。利用第二x軸的滑面來增加系統(tǒng)的固定性，能依次產(chǎn)生更快的定位以及通過工作平臺的準(zhǔn)確一致性。這些特點允許在精確率下的快速運動，使機械手能在一秒內(nèi)對兩塊顯微鏡載玻片操作。

　　帶有筆尖的點樣筆支持物裝置是一個重要的部分。我們的設(shè)計結(jié)合了線形運動，控制點樣筆的方向，允許在最小的阻力下精確地縱軸運動，以防止在其他方向上的錯位。我們設(shè)計的另一個獨特之處是可調(diào)整的末端絲，允許在10μm的范圍內(nèi)校直每個點樣筆的軸，以保證所有12支筆尖能在同一時間內(nèi)接觸顯微鏡玻片。而另一個沒有這特點的設(shè)計需要與點樣筆的精確長度一致以適應(yīng)多點樣筆的操作。每個點樣筆由低強度的彈簧作為支持，保證在未接觸表面時能回到伸展的位置。筆尖是由直徑大約為1.6mm的不銹鋼材料逐漸處理變細直至每點直徑為100μm。再沿著中心垂直切割，在尖端分成兩部分，每部部分5μm。

　　這個系統(tǒng)由可視基礎(chǔ)程序控制的，在Microsoft Windous NT環(huán)境下運行，軟件提供：印刷程序具體化；完成系統(tǒng)校正；顯示真正地時間位置、速度和產(chǎn)生的錯誤；與其他功能參數(shù)一樣重要的隨動系統(tǒng)；動態(tài)地顯示打印過程中的重要參數(shù)。隨動系統(tǒng)控制的計算機中的插件能夠動態(tài)地控制高速、復(fù)雜的機械手的動力，并設(shè)計成以它的運動來控制程序的語言。可視原理和隨動插件運動控制程序相互作用，交換了參數(shù)、圖象和所需的命令。微量滴定板的同一性是由掃描它的閱讀器所決定的。由于有筆尖易被灰塵和纖維阻礙的問題，打印機現(xiàn)在被附上了軟保護壁允許三個方向的隨意進入并且合并了高效率效式空氣過濾與吹風(fēng)機以達到濕氣的再流通。

　　操作

　　打印的第一步是將顯微鏡載載玻片以統(tǒng)一的形式排列在工作平臺上，用在激光平臺上的1孔作為引導(dǎo)，然后按下。膜微量滴定板固定器突然定位在平臺的某一位置，用同樣的孔來排列自己。同樣的微量滴定板固定器保持在沖洗狀態(tài)，也能被放置在任何方便的位置。使用者可任意選擇保留的配置或進入配置中的參數(shù)。緩慢移動模式用于校驗，使坐標(biāo)位置正確。最后，使用者提示增加微量滴定板，機械手進入自動點樣操作。點樣筆從微量滴定板中收集樣品并點樣，從而對每塊載玻片進行同樣的操作。然后沖洗/干燥操作，再對新的樣品進行重復(fù)操直到當(dāng)所有的樣品全部完成。在點樣的過程中，程序自動地將同一來源的微量滴定板保留在磁盤上，優(yōu)化每一點以及載玻片上的X-Y終點位置。這個文件稍后與基因說明文件合并，產(chǎn)生載玻片上已印好的點的復(fù)合說明。

　　觀察

　　點大小的精確性依賴著筆尖的規(guī)格。尖端精細的槽口要求特殊的微加工工具就象Wire EDM。我們用的筆尖是TeleChem的，與我們的筆軸相匹配。它們的性能是可接受的，雖然它們是十分脆的。我們希望能獲得有進展，更耐用的樣式。

　　掃描儀特點

　　我們設(shè)計和制造的激光掃描儀IRIS，是Standford大學(xué)和國家健康研究所研制的器械的衍生產(chǎn)品，使靈敏度和動態(tài)范圍最大化。我們也試圖將運轉(zhuǎn)的適應(yīng)程度結(jié)合到設(shè)計中，因此在將來能夠進行改進，允許更有效的熒光染料的測定（最近引進了DNA自動測序儀）。兩個有染料標(biāo)記的目標(biāo)雜交后，玻片被掃描后產(chǎn)生16位TIF圖象。每點的象素強度是與染料分子的數(shù)量以及與PCR產(chǎn)物斑點雜交探針數(shù)量成比例。

　　設(shè)計特點

　　激光掃描儀有一些關(guān)鍵的組成。軟件是與HPVEE繪圖程序語言同步的程序。規(guī)劃圖形的運動，控制A/D轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)的捕獲，處理兩個頻道的信號，顯示每一次掃描的真實的時間參數(shù)，產(chǎn)生TIF文件的標(biāo)題以及保存TIF圖象的結(jié)果。八個樣本引進的數(shù)據(jù)平均為每一個象素，轉(zhuǎn)換為二進制整數(shù)，為校正圖象的變化，輪流進行的掃描，然后保存。使用者可以看見大屏幕的示波境波形就是每次掃描的平均值，最小值和最大值統(tǒng)計。

　　操作

　　自動化分級操作搜索掃描模式，在X軸的方向上連續(xù)地通過顯微鏡載玻片，然后在Y軸的方向上移動一個象素的位置，產(chǎn)生一個bi-方向的光柵模式。X軸的信號解碼器是由特殊設(shè)計的觸發(fā)回路處理的，取消了每次掃描后的隨動震動，產(chǎn)生了在所有方向上的A/D轉(zhuǎn)換的清晰觸發(fā)。回路保證了微米以下的空間分辨率和圖象的線性結(jié)構(gòu)。兩條激光光柱合成聯(lián)合直線，通過雙重光束分割濾波器反射過目標(biāo)，形成刺激顯微鏡載玻片上染料分子發(fā)熒光的精細聚焦光束。部分熒光是由目標(biāo)分子捕獲的，通過雙光分裂濾波器發(fā)送，在濾波立方中分成紅綠兩種信號，在波段通過器中過濾。發(fā)送入各自的轉(zhuǎn)換電信號的光電管（PMT0）中。每個光電管被A/D轉(zhuǎn)換器放大，過濾和采樣。轉(zhuǎn)換器完成8個附加抽樣，軟件達到平均每象素8個樣本，產(chǎn)生真實的16位分辨率的圖象。

　　觀察

　　我們最初獲得了不恰當(dāng)?shù)男旁氡龋�因此制定了雙成分過濾器，（根據(jù)濃度）建立了我們規(guī)格，降低DC成分的干擾水平。立體過濾成分的去除，進一步改進了靈敏度。我們原先的設(shè)計有包括兩個相配的聚焦鏡的立體過濾器，小孔和不同的元件，這些如果組合在一起形成了共焦顯微鏡。但是我們發(fā)現(xiàn)光學(xué)共焦不能加強檢測。事實上，鏡頭使干擾水平增加了兩倍，這是由于自動的熒光性-整個裝備導(dǎo)致了所需信號相當(dāng)大的衰減，結(jié)果所有信噪比大大地減弱。我們因此推斷在X軸方向的立體過濾在應(yīng)用中沒有起到作用。我們發(fā)現(xiàn)激光輸出的清晰過濾對降低干擾是基本的。最后，為了達到可視成分的精細排列和精確的最佳聚焦，利用了刻度載玻片和軟件，獲得了高靈敏度的雙物鏡系統(tǒng)和廣大的動態(tài)視野范圍。

　　有時遇到的問題是鏡子干擾的存在，由十分明亮但比我們所需的點的圖象要小（<1μm-25μm）的信號組成。我們認為這是由于灰塵和沒結(jié)合的染料所形成的。在干凈的環(huán)境中操作，嚴格遵守雜交程序?qū)�減少這些影響是十分必要的。

　　在屏幕上顯示的波形是可重復(fù)的。當(dāng)比較同一行的重復(fù)掃描，我們發(fā)現(xiàn)極好的重復(fù)性。從中我們降低了由于掃描儀的光學(xué)和電子學(xué)因素而沒傳入的有用信號所產(chǎn)生的變形。當(dāng)調(diào)節(jié)不同的控制參數(shù)時，這個顯示能力也使我們精確地測量了在信號-干擾率上的影響。PMT冷卻是包括在保持電子干擾最小化的設(shè)計中的。迄今為止，當(dāng)PMT冷卻到-18℃時，我們還沒有找到在提高靈敏度方面的巨大進展。系統(tǒng)的干擾水平還沒有達到電子干擾的水平，它的重要元件仍舊有光學(xué)干擾。可能是雜交進程中在載玻片上留下了一些自動顯示熒光的殘余。我們正開發(fā)新的方法來進一步減少干擾水平。

　　從目前系統(tǒng)的靈敏性來看，10 mW激光的能量看來是足夠的，5mW就能產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果，并且顯示了在這個區(qū)域中系統(tǒng)的增進是直線的。PMT的電壓和激光能量是可交換的，不需要降低信號-干擾率。

　　性能

　　比較掃描儀的性能，通常沒有可接受的標(biāo)準(zhǔn)。為了測定我們掃描儀的性能，通過利用一些包含不同濃度Cye3染料校準(zhǔn)的載玻片來測定靈敏性。結(jié)果顯示掃描儀能可靠地測定在100μm點上少于10-18 摩爾的染料的濃度。我們試圖實現(xiàn)對染料結(jié)合和雜交能力測定的附加實驗，但是性能顯示我們用目前的探針預(yù)備方法能探測到低量的mRNA。初步的結(jié)果顯示我們的掃描儀有比市場上的掃描儀高四倍的靈敏度，同時能處理多三倍的信號（在飽和狀態(tài)前）。我們的掃描儀有超過1000倍的動態(tài)范圍，明顯比高密度過濾器的10倍的動態(tài)范圍要好。我們能同時進行雙色成像，但是是有限制的，因為有兩個通道之間的干擾。這能通過在一個時間掃描一種顏色的方法而最小化，雖然當(dāng)每塊載玻片用兩種以上的染料時，交叉激發(fā)仍能產(chǎn)生干擾現(xiàn)象。由我們的系統(tǒng)產(chǎn)生的典型的芯片，掃描用典型的12.8μm的象素大小，能產(chǎn)生16位分辨率的2048 by 1550象素的圖象。每個點覆蓋了大約100個象素，成像的掃描時間大約是40分鐘。

　　雜交注意事項

　　DNA的數(shù)量。芯片上每點DNA的數(shù)量是可估計的。猜想每點堆積的形狀是半球形的，它的容量是可以計算的：

一點的量=1/2 × (4/3πr3 )

每點的DNA的數(shù)量=樣本的濃度 × 每點的量

　　斑點的容量少意味著用于雜交的探針的數(shù)量也很少，即使樣本的濃度很高。必須努力減少這樣的限制。一些因素必須考慮到，除了探針DNA的數(shù)量外，還有與目標(biāo)分子相互補的探針DNA的比例，長短，目標(biāo)分子的活性，就象用于檢測信號方法的靈敏度影響著信號的強度。

　　雜交信號的濃度是與目標(biāo)分子活性成比例的，與它的長度成反比，因此目標(biāo)分子的特殊活性是十分重要的。每次實驗的雜交時間也應(yīng)該精確測量。

　　沉積機制

　　點樣筆的精確切口允許利用毛細現(xiàn)象從微量滴定板中吸取樣本。壓力由點樣筆向下的運動產(chǎn)生，載玻片的表面張力拖動樣本從切口內(nèi)到玻片上。點的大小依賴于點樣筆向下及離開載玻片的加速度和載玻片表面的張力。點樣筆向玻片的加速度與點的大小成比例，因此能調(diào)整到所希望的點的大小。當(dāng)點樣筆從玻片收回后，在切口內(nèi)的樣品和沉積在載玻片上的樣本之間的流量就形成了。如果收回的速度很快尖端的量就被打斷了，產(chǎn)生了大的點，不是完美的半球形。如果收回的速度十分慢，點樣量就在尖端"修剪"了，留下的點就小。

　　DNA樣本

　　樣本準(zhǔn)備在96孔的板上，乙醇沉淀并用70%的乙醇洗滌,然后在2×檸檬酸鈉（SSC）中重建。樣本濃度的重建依賴于所需點的大小和樣本的粘稠度。如果樣本需要排列為小的點，它們的濃度就要高。但是，限制因素是筆尖的設(shè)計，會使樣本粘稠而難以排列，那些濃度大于2μg/μl的太粘了而不能點樣。我們點樣的目標(biāo)濃度是每個樣本15ng一個點。雖然我們在2SSC中重新建立了樣本，但是溶液的離子濃度能在1×SSC到5×SSC之間而不影響雜交，然而樣本溶解在溶液中后離子濃度高于5×SSC就很難與載玻片接觸。

　　將DNA固定到玻璃片

　　在DNA排列到玻片上以后，它們是自然干燥的。樣本的固定是通過紫外線（UV）固定的，形成在DNA上的胸腺嘧啶脫氧核苷殘基和硅烷玻片上氨基之間的共價鍵。類似的方法也用于將DNA樣本固定在尼龍膜上。為了完成最大化的雜交，要在紫外線交聯(lián)之前，芯片要保持微量的濕潤，通過將"排列"暴露在沸水中，然后在254nm的紫外線下暴露到0.27J/cm2 。我們發(fā)現(xiàn)精密測量照射的量是十分有利的，只要確定產(chǎn)生最佳信號的照射最佳水平。過長時間的照射導(dǎo)致了由于連接不充分而產(chǎn)生的DNA損失和個別地，DNA樣本的過多的斷裂。在交聯(lián)后，過多的DNA分子在室溫下被0.1%的SDS沖洗掉，然后在雜交以前，排列的樣本在95℃的水中變性。

　　雜交中的

　　有許多方法使目標(biāo)分子和探針進行雜交。我們發(fā)現(xiàn)三個工作溶液對于熒光探針和固定在玻璃上的DNA的雜交是很好的；與溶劑和溫度不相關(guān)。一般來說，在42℃，甲酰胺基礎(chǔ)上的雜交比65℃水溶液中的要好，因為促進了信號和雜質(zhì)的比率。但在甲酰胺中的動態(tài)雜交要比在水溶液中的慢，當(dāng)用低拷貝量的目標(biāo)分子時，建議使用有右旋糖苷硫酸鹽或聚乙烯乙二醇的水溶液。

　　類似的方法用于使"雜質(zhì)"最小化：用Denhardt試劑，十二烷基硫酸鈉（SDS）修剪鮭精DNA，tRNA和Cot1DNA。當(dāng)我們用cDNA時，也包括多聚A RNA或與富含T的序列相連接的多聚A。

　　討論

　　我們集體的努力顯示了在學(xué)術(shù)環(huán)境下如何實現(xiàn)芯片技術(shù)的。在AECOM，芯片和掃描儀是由家庭工程師制造的，使用家庭工程師的好處是她/他是親手改良和維修儀器的。在Pennsylvania大學(xué)，芯片是在大學(xué)機械店的幫助下在實驗室中制造的；掃描儀（General掃描儀公司）是購買的。

　　芯片構(gòu)建的改良技術(shù)必須與基因組克隆圖譜實用性的增加，好的cDNA克隆，分析工具的良好使用相匹配。這些工具的綜合和易操作性對基因研究發(fā)展的速度是十分重要的。