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感受態細胞的制備

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-06-29

1、 受體菌的培養

從平板上挑取新的活化后的E.coli TG1單菌落,接種于5ml LB液體培養基中,37℃下振蕩培養12小時左右,取50ul培養液轉入5ml LB中,37℃振蕩培養1~1.5小時至對數生長期OD600=0.5左右。

2、 感受態細胞的制備

⑴、將培養液1.5ml轉入離心管中,冰上放置20分鐘。

⑵、置于4℃,5000rpm離心5分鐘,倒盡上清。

⑶、添加一半菌液體積(750ul)預冷的50mM的CaCl2,用槍輕輕吹打,使細胞懸浮,

冰上放置30分鐘。

⑷、4℃,5000rpm離心5分鐘,棄上清。

⑸、再加入200ul預冷的50mM的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置備用。

新鮮的感受態細胞在4~24小時之內可直接用于轉化,也可加入總體積15%的無菌甘油,

混勻后置于-70℃可保存6個月,轉化效率基本不變。

3、轉化

⑴、取200ul搖勻后的感受態細胞懸液,加入質粒4ul,用槍輕輕吹打均勻,冰浴30分鐘。

⑵、42℃,保溫90秒鐘后,迅速放入冰中,冰浴5min。

⑶、加入37℃預熱的1ml的LB液體培養基,混勻。37℃培養1小時,使細胞恢復正常生長狀態。

⑷、3000rpm離心10分鐘。

⑸、棄去1ml上清,余下的200ul用槍輕輕吹打均勻,使細菌充分懸浮后均勻涂布于含Amp的篩選平板上。

⑹、37℃正面向上放置半小時后,倒置培養8~12小時。

對照1、以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與轉化組相同。

對照2、以同體積的50mM的CaCl2溶液代替感受態細胞懸液,其它操作與轉化組相同。

 
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