（一）濾膜的準備

提取基因組（染色體）DNA
用適當限制性內切酶（如BamHI、EcoRI、HindIII或Pst I）消化DNA，

重蒸水 11µl

基因組DNA 5µl（3-5µg）

10×緩沖液 2µl

限制性內切酶 2µl

總量為20µl

3. 37℃條件下保溫10-24小時。

4. 取2µl樣品在0.7-1%凝膠上在TBE溶液中進行電泳檢查。

5.確定后，樣品與DNA分子量標準一起膠電泳。

6.電泳結束后，在凝膠的側沿放一把直尺進行拍照，并做標號。

7.將電泳凝膠用蒸餾水沖洗后，放入100ml depurination solution中，室溫條件下緩慢振動浸泡15min。（膠顯黃色)

8.凝膠蒸餾水沖洗后，轉移到100ml 變性溶液中緩慢振動浸泡20分鐘，換新的變性溶液，再振動浸泡20分鐘。（膠顯藍色）

9.水洗凝膠后，轉移到中和溶液緩慢振動浸泡15，然后換溶液后，再浸泡15min。

10.毛細管作用，將DNA從瓊脂糖凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。

取出雜交尼龍膜，在其上面做上記號，在6×SSC溶液中非常緩慢轉動條件下清洗5min。（含有DNA面朝上）將其從溶液中取出，放在Whatman 3MM濾紙上，讓其自然風干。 夾在兩張濾紙中，放在80℃條件下烘烤2小時，使其完全固定。

（二）探針的標記

1、取10ng-30g DNA,，用雙蒸水定容至15μl.

2、在沸水浴中變性DNA 10 min，迅速放入冰浴中。

3、在變性DNA中添加下列試劑

六聚寡核苷酸 2μl

dNTP標記混合物 2μl

Klenow enzyme 1μl

總體積20μl

4、混勻、少許離心后，在37℃條件下培養。

5、添加2μl的0.2 EDTA（PH8.0）,或者65℃加熱10分鐘終止反應。

（三）雜交：

1、預熱適當體積的DIG Easy Hyb (2ml/100cm2膜)

2、在合適的容器中，預雜交膜30min，柔和搖動，預雜交。

3、在沸水浴中5min，變性大約25mg/ml的DIG標記DNA探針，然后迅速在冰浴中冷卻。

4、倒去雜交液，添加探針和雜交液到膜，在緩慢振動情況下保溫雜交6h或者過夜。

5、用洗液Ⅰ（2*ssc,0.1℅SDS）在室溫條件下洗2次，每次15min。

6、用預熱的洗液Ⅱ（0.5*ssc,0.1℅SDS），在65-68℃的條件下，搖動洗2次，每次15min。

（四）免疫檢測：

1、 雜交后，洗液中漂洗膜1-5min

2、 在100ml終止液中（blocking solution）,保溫30min。

3、 在200ml抗體溶液（Antibody solution）中保溫30min。

4、 用100ml洗液洗2次，每次15min。

5、 用20ml檢測液平衡2-5min。

6、 在黑暗中，加10ml colorsubstrate 溶液于適當容器中，保溫。在顯色的過程中不要搖動。（淡色的反應開始在幾秒鐘，在16小時后完全反應）

7、 膜曝光后短時間內檢測顯色

8、 用ddH2O或者TE buffer洗膜，終止反應。