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RNA的吸印轉移法(Northern blot)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

在RNA凝膠電泳之前,先用乙二醛等變性劑處理RNA,再在適宜條件下電泳使充分變性的RNA直接吸印到硝酸纖維膜上。固定后除去變性劑,然后進行雜交。
試劑:
乙二醛:4mol/L(約為30%),經(jīng)過陰陽離子交換樹脂純化,使pH為5.5~6.0
磷酸緩沖液:80mmol/L pH6.5~7.0 磷酸緩沖液:10mmol/L pH6.5~7.0
Tris-HCl:20mmol/L pH7.8 二甲基亞砜:分析純 20×SSC:0.3mol/L檸檬酸鈉,3mol/L NaCl


基本步驟
1.RNA變性  
吸取1μl 80mmol/L磷酸緩沖液,1μl RNA樣品(最多100μg),2μl,4mol/L 乙二醇,4μl二甲基亞砜�;靹蚝�,50℃水浴1h,然后放入冰中。
2.電泳 變性結束后,加入含有50%甘油的10mmol/L磷酸緩沖液2μl和少量溴酚藍,混勻后點樣于1.0%的凝膠上,以4~5V/cm電壓電泳。凝膠電泳液為10mmol/L磷酸緩沖液, pH6.5~7.0。
3.轉移
變性處理后的RNA可以轉移并結合到硝酸纖維膜上,轉移過程和轉移變性與DNA相同。
4.固定
用20×SSC轉移RNA。膜夾在兩層干凈濾紙中晾干,80℃烤膜2h。
RNA膜固定后,放入20mmol/L Tris-HCl中,100℃處理5~10min,去除乙二醛,然后進行雜交。

 
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鏇村

 

 
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