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基因的化學(xué)合成

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

化學(xué)法主要適用于已知核苷酸序列的、分子量較小的目的基因的制備。在基因的化學(xué)合成中,通常是先合成一定長(zhǎng)度的、具有特定序列的寡核苷酸片段。寡核苷酸片段的化學(xué)合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法,以及在后者基礎(chǔ)上發(fā)展起來的固相合成法和自動(dòng)化法。


磷酸二酯法

基本原理是將一個(gè)5’端帶有適當(dāng)保護(hù)基的脫氧單核苷酸與另一個(gè)3’端帶有適當(dāng)保護(hù)基的脫氧單核苷酸偶聯(lián)起來,形成一個(gè)帶有磷酸二酯鍵的脫氧二核苷酸分子。


亞磷酸三酯法

原理是將所要合成的寡核苷酸鏈的3’末端先以3’-OH與一個(gè)不溶性載體,如多孔玻璃珠連接,然后依次從3’-5’的方向?qū)⒑塑账釂误w加上去,所使用的核苷酸單體的活性官能團(tuán)都是經(jīng)過保護(hù)的,其中5’-OH用4,4-二對(duì)甲氧基三苯基保護(hù),3’-端的二丙基亞磷酸酰上的磷酸的OH,用甲基或?氰乙基保護(hù)。


寡核苷酸連接法

目前,化學(xué)合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150-200bp,而絕大多數(shù)基因的大小超過了這個(gè)范圍,因此,需要將寡核苷酸適當(dāng)連接組裝成完整的基因。


常用的基因組裝方法主要有兩種:

第一種方法是將寡聚核苷酸激活,帶上必要的5’-磷酸基團(tuán),然后與相應(yīng)的互補(bǔ)寡核苷酸片段退火,形成帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段,再用T4DNA連接酶將它們彼此連接成一個(gè)完整的基團(tuán)或基團(tuán)的一個(gè)大片段。

第二種方法是將兩條具有互補(bǔ)3’末端的長(zhǎng)的寡核苷酸片段彼此退火,所產(chǎn)生的單鏈DNA作為模板在大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段作用下,合成出相應(yīng)的互補(bǔ)鏈,所形成的雙鏈DNA片段,可經(jīng)處理插入適當(dāng)?shù)妮d體上。

 
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