瓊脂糖凝膠電泳可用于分離、鑒定和提純DNA片段。本法操作簡(jiǎn)單、迅速,能分辨其它方法不能分開(kāi)的DNA片段混合物,分開(kāi)的DNA可用低濃度的螢光染料(0.5μg/ml溴化乙錠)染色,在紫外燈下直接觀察檢測(cè)少至1ng的DNA。
DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠的遷移率取決于以下參數(shù):
①DNA分子的大小
線狀雙鏈DNA分子通過(guò)凝膠的速率與其分子量的常用對(duì)數(shù)成反比。據(jù)此用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測(cè)分子量的DNA片段同時(shí)電泳,比較其電泳速率,即可求出待測(cè)片段的分子大小。
②瓊脂糖濃度:
給定大小的DNA片段,以不同速度通過(guò)不同濃度的瓊脂糖凝膠。因此利用不同濃度的凝膠,可分辨范圍廣泛,大小不同的DNA片段。
③DNA構(gòu)型
相同分子量的閉環(huán)(Ⅰ型),開(kāi)環(huán)(Ⅱ型)和線狀(Ⅲ型)DNA,以不同速率通過(guò)凝膠,一般情況下,遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。
④應(yīng)用的電壓
在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成正比。但是電壓增高時(shí),大分子量DNA片段遷移率的增大是不同的,因此瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨電壓增大而減小。為了獲得DNA片段的最大分辨力,凝膠電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)5V/cm。
DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠的遷移率取決于以下參數(shù):
①DNA分子的大小
線狀雙鏈DNA分子通過(guò)凝膠的速率與其分子量的常用對(duì)數(shù)成反比。據(jù)此用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測(cè)分子量的DNA片段同時(shí)電泳,比較其電泳速率,即可求出待測(cè)片段的分子大小。
②瓊脂糖濃度:
給定大小的DNA片段,以不同速度通過(guò)不同濃度的瓊脂糖凝膠。因此利用不同濃度的凝膠,可分辨范圍廣泛,大小不同的DNA片段。
③DNA構(gòu)型
相同分子量的閉環(huán)(Ⅰ型),開(kāi)環(huán)(Ⅱ型)和線狀(Ⅲ型)DNA,以不同速率通過(guò)凝膠,一般情況下,遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。
④應(yīng)用的電壓
在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成正比。但是電壓增高時(shí),大分子量DNA片段遷移率的增大是不同的,因此瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨電壓增大而減小。為了獲得DNA片段的最大分辨力,凝膠電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)5V/cm。