一、菌體的裂解
1、怎樣裂解細(xì)菌？
細(xì)胞的破碎方法
1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。
2.玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。
3.超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施，時(shí)間以及超聲間歇時(shí)間、超聲時(shí)間可以自己調(diào)整，超聲完全了菌液應(yīng)該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對(duì)超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應(yīng)慎用。
4.反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。
5.化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1mg/ml。
無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應(yīng)該在破碎的同時(shí)多加幾次；另外，還可通過(guò)選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。
這是標(biāo)準(zhǔn)配方:
裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在這個(gè)pH范圍內(nèi)比較好發(fā)揮作用)
但我個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)是:如果你裂解細(xì)菌是為了提取蛋白的話,而且蛋白的分子量又小于20kd的話,盡量減少溶菌酶的用量,會(huì)引入溶菌酶這種雜蛋白.一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一點(diǎn)就夠.判斷裂解好壞的標(biāo)準(zhǔn)是,溶液很粘.
protocol是10ml-50ml緩沖液(菌體洗滌液,裂解液等)/1g濕菌體.
如果只做一個(gè)鑒定,我覺(jué)得100-200ml菌就夠了.
但凡超聲,我都用60ml裂解液,因?yàn)槲覀兊某晝x(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)錄象里的那種)很適合用100ml小燒杯,裝60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液面不高不低,不會(huì)冒泡泡,也不會(huì)灑出來(lái).菌多我就延長(zhǎng)超聲時(shí)間.
沉淀,也就是包涵體沉淀了,如果要上柱純化,一定要先用4M尿素洗滌一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑電泳,可以直接用8M尿素溶解以后,離心取上清,加入適量體積的loading buffer.loading buffer對(duì)于包涵體的溶解能力是較弱的.
"取200微升菌液，離心后直接加上樣buffer，100度3分鐘后上樣，然后SDSPAGE. 這個(gè)方法到底能不能溶解細(xì)菌中的包涵體? "
而樓主的問(wèn)題,雖然loading buffer對(duì)于包涵體的溶解能力是較弱的,但是我覺(jué)得你的做法只是在鑒定有無(wú)表達(dá),用loading buffer是沒(méi)有問(wèn)題的.
2、表達(dá)重組蛋白時(shí)，細(xì)菌裂解方法都有哪些？
在表達(dá)重組蛋白時(shí)，誘導(dǎo)以后跑SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)表達(dá)都很好，但是在裂解細(xì)胞時(shí)遇到問(wèn)題。總是不能徹底裂解細(xì)胞。
首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細(xì)菌沒(méi)有裂解。
我的超聲條件如下：寧波新芝超聲細(xì)胞破碎儀，功率400W，超5秒，間隔5秒，重復(fù)99次。然后顯微鏡觀察，不徹底時(shí)再重復(fù)99次。菌體來(lái)自200 ml培養(yǎng)液，用20 ml PBS重懸。
然后我又嘗試加溶菌酶，首先加至終濃度100 ug/ml，4C半小時(shí)菌液不變粘，加大濃度至1 mg/ml，半小時(shí)后仍無(wú)明顯變化。因?yàn)槲矣玫腜BS是pH7.4，我懷疑是pH不合適，換用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小時(shí)仍無(wú)明顯變粘。因?yàn)檫@次使用的溶菌酶是前一天配好的，擔(dān)心溶菌酶失效，重新稱取凍干粉末，直接加入菌液，仍然沒(méi)有明顯變化。
真是郁悶。到底出了什么事？請(qǐng)高手解答，并介紹優(yōu)化的方案。
同時(shí)希望能介紹一下如何選擇細(xì)胞破碎方法，以及如何確定最佳條件。
溶菌酶在pH7.4時(shí)是否沒(méi)有活性了？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應(yīng)如何保存？
加入溶菌酶以后，如果細(xì)胞壁已破壞，菌液應(yīng)該變粘吧，因?yàn)楹怂岜会尫懦鰜?lái)。
而超聲破碎細(xì)胞，我覺(jué)得菌液是不會(huì)變粘的，因?yàn)槌暱梢园汛蠓肿雍怂岽蛩槌尚∑巍?
我判斷細(xì)胞破碎不完全是因?yàn)椋趯⑵扑楹髽悠冯x心分離上清和沉淀跑SDS-PAGE觀察，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞碎片組分中除了經(jīng)常出現(xiàn)的一兩條帶以外，還有菌體總蛋白樣品中的很多帶出現(xiàn)。據(jù)此可以判斷細(xì)胞只是部分破碎。
不知我的分析是否正確，請(qǐng)版主和各位高手指教。
如果溶菌酶效果還可以，我覺(jué)得先用溶菌酶初步裂解細(xì)胞，然后再用超聲進(jìn)一步破碎并斷裂大分子核酸以降低粘度的細(xì)胞破碎策略可能比較好。因?yàn)槌曈锌赡苁沟鞍鬃冃裕珕斡萌芫覆荒艽_定是否完全破碎，還要再加核酸酶降低粘度。這種兩步法策略應(yīng)該還可以減少破碎條件優(yōu)化的時(shí)間。
我用的溶菌酶放置時(shí)間比較長(zhǎng)了，有可能失活了。我剛從生工又定了一支，不過(guò)得后天到貨，但愿它有用。
如何觀察溶菌酶是否已裂解細(xì)胞，通過(guò)觀察粘度變化是否可以？
只反復(fù)凍融是否可以有效裂解大腸桿菌細(xì)胞？
溶菌酶只有在pH值大于8.0的條件下才能發(fā)揮溶菌作用，請(qǐng)務(wù)必保持PBS的pH＞8.0，同時(shí)溶菌酶的量一定要足！
在加入溶菌酶后，最好放于磁力攪拌器上攪拌30分鐘，再進(jìn)行超聲破菌，我的超聲條件是：功率400W，工作2秒，間隔2秒，重復(fù)199次。菌體來(lái)自500 ml培養(yǎng)物，用30 ml PBS重懸，超聲效率還是可以的。
哪兒的溶菌酶好用？
我用生工的溶菌酶，稱取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重懸，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，將溶菌酶干粉加入體系，混勻，測(cè)pH降低到5－6，加20 ul 2M Tris堿，體系pH升到～8。4C放置1小時(shí)，菌液上層變澄清，搖動(dòng)發(fā)現(xiàn)體系沒(méi)有變粘。測(cè)pH仍在8左右。再37C保溫1小時(shí)，還沒(méi)有變化，我簡(jiǎn)直不知如何才好了。
另一瓶200ml培養(yǎng)物，溶菌酶處理1小時(shí)后超聲。條件：300W，超5秒停5秒，重復(fù)99次。菌液有變化，但很不明顯。繼續(xù)超聲400次，從外觀來(lái)看沒(méi)有太大區(qū)別。我簡(jiǎn)直要說(shuō)tmd了。見(jiàn)鬼了。
我的操作有什么地方不妥當(dāng)，請(qǐng)各位指正。
溶菌酶的廠商要求是否很重要？
我的誘導(dǎo)物來(lái)自1：20過(guò)夜培養(yǎng)物接種，37C生長(zhǎng)3小時(shí)后30C誘導(dǎo)2小時(shí)（0.8mM IPTG）。
是否菌液太濃，Pharmacia的說(shuō)明書(shū)200 ml培養(yǎng)物用10 ml重懸，我用20 ml，仍然不夠稀？有人告訴我菌液應(yīng)該稀一些，200 ml用30－40 ml重懸。但實(shí)際操作也不夠理想。
SDS-PAGE總是觀察到細(xì)胞破碎效果不夠徹底。超聲那么多次，蛋白都要被超碎變性了。
3、酵母的破碎
酵母是一類單細(xì)胞真菌的總稱，其成員分別屬于不同的真菌綱，細(xì)胞壁成分是否會(huì)有較大差別，這些都是做破碎酵母細(xì)胞前要考慮的。我歸納了一下，做破碎酵母的幾種方法：
1 機(jī)械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超聲，蛋白活性保持較好。
2 化學(xué)裂解的方法：10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀（希望高手點(diǎn)評(píng)）
3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高壓勻漿。（這個(gè)好象也該在方法2中）
4 液氮凍融并研磨酵母破壁，我認(rèn)為這種可能在小試中比較合適。
5 溫和的酶法，可能不會(huì)會(huì)破壞酵母原生質(zhì)體
酶法裂解主要用兩種酶：1。蝸牛酶，可以直接從蝸牛的胃液中獲得；2。lyticase，可以從sigma定購(gòu)。這兩種酶解法都可以和上面的幾種方法結(jié)合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。
我用過(guò)化學(xué)裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀。此法的裂解效果不錯(cuò)的，不妨試一下。
一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），據(jù)說(shuō)效果可以
酵母破碎效果好的我所做過(guò)的方法中還是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所說(shuō)的那樣，效率很高的，而且對(duì)目的蛋白活性不會(huì)有什么影響。一般應(yīng)該用這個(gè)方法。
4、超聲破碎的條件選擇
超聲破碎的條件不能一概而論，要看你的實(shí)驗(yàn)要求，有的是細(xì)菌破碎，有的是對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行破碎，要掌握好功率和每次超聲時(shí)間，功率大時(shí)，每次超聲時(shí)間可縮短，不能讓溫度升高，必要時(shí)在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。至于每次超聲時(shí)是否起泡沫到不是關(guān)鍵的問(wèn)題，這與你超聲的量明顯有關(guān)。
5、如何鑒定細(xì)菌超聲破碎的程度
最簡(jiǎn)單的方法：涂片--革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘---顯微鏡觀察
切記：只用結(jié)晶紫染色，別忘了染色后再用水稍沖洗一下
6、細(xì)菌裂解的DNaseI
不同純度的酶換算標(biāo)準(zhǔn)不同，所以你最好查查是哪個(gè)公司的酶？仔細(xì)看說(shuō)明書(shū)，可能會(huì)有換算說(shuō)明。
另外看一下參考文獻(xiàn)所用的酶是哪個(gè)公司的，到該公司的主頁(yè)也可能有收獲。
我用過(guò)華美和TAKARA的DNA酶，華美的是用mg/ml。華美也有RNase free的DNA酶，定量用活性單位。TAKARA的兩種酶都是用活性單位定量的。
我在超聲裂解細(xì)菌時(shí)加入一些DNA酶，一般用超聲液加不同量的酶做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取符合你需要的酶量。
其實(shí)根據(jù)目的和方法的不同，所需要的酶量也是可調(diào)節(jié)的，比如酶切溫度（16度或37度）。
7、超聲裂解細(xì)菌是否完全？
最簡(jiǎn)單的方法：涂片--革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘---顯微鏡觀察
切記：只用結(jié)晶紫染色
二、包涵體的洗滌
1、包涵體的洗滌問(wèn)題
通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，我以前是這么做的，先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過(guò)濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，你可以找到一個(gè)合適去除雜質(zhì)的辦法，其實(shí)這就是梯度沉淀的方法，我覺(jué)得比通常的直接洗脫效果好。
包涵體一般難溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑電泳對(duì)比，因?yàn)橛袝r(shí)候難溶解的就是你的目標(biāo)蛋白，所以每次處理都要把上清和沉淀跑電泳對(duì)比，免得把目標(biāo)蛋白弄丟了。
此外剛處理完的包涵體好溶解。冷凍后難溶解，溶解也需要長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)間，也需要大量的溶劑。如果說(shuō)是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比較純的包涵體
對(duì)于包涵體的純化，包涵體的前處理是很重要的。
包涵體中主要含有重組蛋白,但也含有一些細(xì)菌成分,如一些外膜蛋白、質(zhì)粒ＤＮＡ和其它雜質(zhì)。洗滌常用1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和還原劑2-巰基蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇等反復(fù)多次進(jìn)行，因去垢劑洗滌能力隨溶液離子強(qiáng)度升高而加強(qiáng)，在洗滌包涵體時(shí)可加50 mM NaCL。這樣提取的包涵體純度至少可達(dá)50%以上，而且可保持元結(jié)構(gòu)。也可用低濃度的鹽酸胍或尿素/中性去垢劑/EDTA/還原劑等洗去包涵體表面吸附的大部分不溶性雜蛋白。洗滌液pH以與工程菌生理?xiàng)l件相近為宜，使用的還原劑為0.1-5mM。EDTA為0.1-0.3 mM。去垢劑如Triton X-100、脫氧膽酸鹽和低濃度的變性劑如尿素充分洗滌去除雜質(zhì),這一步很重要,因?yàn)榇竽c桿菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵體的溶解和復(fù)性過(guò)程中可導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的降解。
對(duì)于尿素和鹽酸胍的選擇：
尿素和鹽酸胍屬中強(qiáng)度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對(duì)包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時(shí)間較長(zhǎng)或溫度較高時(shí)會(huì)裂解形成氰酸鹽，對(duì)重組蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行共價(jià)修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會(huì)造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn)，故目前已被廣泛采用。
鹽酸胍溶解能力達(dá)95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對(duì)蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點(diǎn)。
包涵體最后的純化，一般是離子交換，疏水，或者是親和層析，親和層析尤其是金屬螯合層析用得比較廣泛，而純化的效果也不錯(cuò)，通常是一步就能達(dá)到純度為95%以上的包涵體。
8M高濃度尿素溶解后離心獲得的包涵體溶解液，放在4度冰箱過(guò)夜后出現(xiàn)沉淀，這種現(xiàn)象我也在實(shí)驗(yàn)中遇到過(guò);開(kāi)始感覺(jué)很奇怪，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是我們的冰箱的溫控出了問(wèn)題實(shí)驗(yàn)際溫度要比設(shè)定溫度低至少4度（呵呵，不好意思！）。不過(guò)我接著往下進(jìn)行SDS-PAGE、層析等發(fā)現(xiàn)沒(méi)有什么不良影響。所以，你不用擔(dān)心也許你的蛋白也只是和你開(kāi)了個(gè)玩笑呢！
三、關(guān)于包涵體的溶解：
1、 請(qǐng)教GST包涵體溶解
直接用8M的脲或 6M胍融解，取上清，測(cè)濃度。直接稀釋后包被檢測(cè)相應(yīng)抗體。（由于快速稀釋相當(dāng)于復(fù)性過(guò)程，產(chǎn)物用于檢測(cè)沒(méi)有問(wèn)題的）
我所用的包涵體提取方法：
1．PBS或生理鹽水洗滌誘導(dǎo)后菌體，Buffer A重懸菌體，超聲波破碎至清亮
２．４度，１００００rpm離心１０分鐘，棄上清
３．用ＰＢＳ或生理鹽水洗滌沉淀２－３次
４．往沉淀中加１９．７ml Buffer A及０．３ml ２０％的ＳＫＬ（十二烷基肌氨酸鈉）貯存液，劇烈攪動(dòng)，使其緩慢溶解，室溫靜置３０分鐘至２小時(shí)
５．４度，１００００rpm離心１０分鐘，取上清
６．加２０％ＰＥＧ４０００ ２１０ul至終濃度為０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至終濃度為１mM,加100mM的還原型谷胱甘肽４２０ul至終濃度為２mM,靜置３０分鐘至２小時(shí)（亦可４度復(fù)性過(guò)夜）
７以ＰＢＳ（pH8.0)或ＴＥ（pH8.0)透析，取出－２０度保存?zhèn)溆?
！Buffer A配方：
Tris-base 50mM
EDTA 0.5mM
NaCl 50mM
甘油 5%
DTT 5mM
2、包涵體的溶解
十二烷基肌氨酸鈉與十二烷基肌氨酸在溶解包涵體時(shí)，可不可以互相代替？可以替換，調(diào)pH不久沒(méi)什么區(qū)別了嗎；兩者的功能團(tuán)相同，pH不同，前者鈉鹽便于保存罷了
3、有關(guān)包涵體的溶解問(wèn)題
強(qiáng)的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl 6M），是通過(guò)離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來(lái)講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因?yàn)辂}酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲酰化，特別是在堿性pH值下長(zhǎng)期保溫時(shí)。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等是去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外，對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒(méi)有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。
4、8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存?
我在4度放了半個(gè)月，目前沒(méi)出什么問(wèn)題
5、8M尿素溶解的包涵體溶液在室溫下可以放多久而不出現(xiàn)問(wèn)題?
BI溶液在室溫放置48小時(shí)，可能會(huì)對(duì)目的蛋白有影響，因?yàn)槟蛩卦趬A性條件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些處理BI溶液比較好。具體有什么影響我也不是很清楚。
6、GST融合蛋白形成包含體不溶，咋辦？
GST融合蛋白應(yīng)該不能用尿素等作用太強(qiáng)的變性劑，否則GST融合蛋白是不能與beads相結(jié)合的
GST的Beads是應(yīng)用酶與底物結(jié)合的原理，所以要去除處理因素后才好結(jié)合，不知你的溫和的去污劑是什么？
做完裂解之后加Triton X－100輕搖３０min，蛋白溶解的會(huì)多些！
四、包涵體的復(fù)性
1、包涵體如何復(fù)性
包涵體的復(fù)性主要有兩種方式：
1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋
2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑
其中透析很適合實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，但是時(shí)間長(zhǎng)。另外，如果蛋白質(zhì)右兩個(gè)以上的2硫鍵，很可能錯(cuò)誤形成配對(duì)，應(yīng)用還原劑。還有，復(fù)性的具體方法還要根據(jù)前期試驗(yàn)及篩選來(lái)確定！
另外，你用多大體積的透析緩沖液？可能不夠，要更換幾次
你家了多少蛋白呀 ？蛋白量過(guò)大也會(huì)使復(fù)性困難。
你用的透析代是否是新的，處理過(guò)沒(méi)有？新代有化學(xué)雜質(zhì)！
最后，有些復(fù)性過(guò)程就是還有沉淀（透析方法的缺點(diǎn)）看看溶液中蛋白含量，說(shuō)不定已經(jīng)夠用了~~
包涵體的復(fù)性還要注意以下幾點(diǎn)：
1.首先要獲得較高純度的包涵體。
2.包涵體溶解要徹底，一般應(yīng)使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施。
3.透析前后均要離心
4.透析不能太快.
5.純化的最佳條件要摸索。
小技巧：
1）包含體要徹底洗滌干凈，洗滌液中加入適量Triton-X100.
2) 包含體溶解后裝入透析袋在復(fù)性液中復(fù)性
3）復(fù)性液的組成很有講究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 還加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h
4) 復(fù)性完畢在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析12-24h
5) 復(fù)性率的測(cè)定 據(jù)變性蛋白和非變性蛋白的光學(xué)性質(zhì)不同測(cè)定（望有經(jīng)驗(yàn)的戰(zhàn)友能更詳細(xì)地講解）
6）TritionX100、SDS這一類去垢劑最后不易去除，在制藥行業(yè)中一般不允許采用。好像SDS最后殘留量不能大于0.5%吧，忘了。
我用Triton洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步，改變培養(yǎng)條件，再洗滌包涵體，有時(shí)可以在上柱前已經(jīng)只剩下3-4條雜帶，這樣后續(xù)的純化就很方便了。因?yàn)樯V柱的純化條件比較難optimize。
這段文字可以參考：
用Novagen公司《pET System Manual》提供的方法，分別進(jìn)行細(xì)菌滲透休克，超聲波裂解，研究融合蛋白在細(xì)胞周質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)和包涵體中的分布。
滲透休克 用1.2.3方法誘導(dǎo)細(xì)菌（10ml體積），測(cè)菌液OD600，10000 r/min離心0.5 min去上清，加入滲透休克溶液1（V1= OD 600×V2/5，V1為滲透休克溶液1，V2為培養(yǎng)新鮮菌液），冰浴10 min，10000 r/min離心0.5 min，去上清。加V1體積滲透休克溶液2重懸，搖動(dòng)冰浴10 min，10000 r/min離心0.5 min，保存上清、細(xì)菌沉淀。作如下處理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加1/10體積100% TCA (w/v)，渦漩15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min離心5 min，100 ul丙酮洗滌沉淀，干燥1 h，加V1/2體積1× PBS（pH 10）溶解，-20℃保存，取10 ul加入等體積2×SB，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系統(tǒng)照相。
超聲波裂解細(xì)菌 滲透休克細(xì)菌沉淀加1/10培養(yǎng)體積20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0℃）重懸，冰浴，超聲波裂解，20%工作選擇，脈沖粉碎1 min，然后13000 r/min離心5 min，-20℃保存上清、細(xì)菌沉淀。上清進(jìn)行TCA沉淀，處理同上。沉淀用Protein Extraction Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供 ）按 Novagen公司《pET System Manual》提供方法反復(fù)處理，洗滌包涵體。包涵體按培養(yǎng)菌100×OD600/3 ul體積加1% SDS溶解，加等體積2×SB，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，進(jìn)行蛋白條帶灰度掃描，計(jì)算融合蛋白Trx-PrPC27-30占細(xì)菌總蛋白的相對(duì)含量。
1.2.7重組融合蛋白的純化
PrP-pET-32a（ ）轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coli BL21（DE3），TB培養(yǎng)基中，25℃，AMP 200 ug/ml，搖床（250 r／min）培養(yǎng)至OD600約為1.5，更換等體積新鮮TB培養(yǎng)基，加入IPTG至終濃度1 mM，AMP 200 ug/ml，25℃，4 h，4000 g離心收集菌體。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用說(shuō)明溶解包涵體，純化融合蛋白。
或使用筆者改進(jìn)方法，將Ni-NTA HiBind Purification Kit使用說(shuō)明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免長(zhǎng)菌。
洗脫所得蛋白用TCA沉淀，處理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，凍干保存。然后12% SDS-PAGE凝膠電泳分析。
3、包涵體復(fù)性2
精氨酸可助溶，但精氨酸是代謝產(chǎn)物高濃度對(duì)人可能不好。
另外甘氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以試一試。
對(duì)于疏水蛋白的可溶表達(dá)，可以降低誘導(dǎo)溫度（可以試試4度誘導(dǎo)過(guò)夜）和IPTG的量，降低蛋白的表達(dá)速度，從而減少包涵體形成的速度，增加正確折疊蛋白的量。或者換成GST融合表達(dá)載體，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表達(dá)。我的蛋白包涵體在經(jīng)變性純化后透析復(fù)性過(guò)程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想對(duì)于你的情況，由于含有二硫鍵，還要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正確的二硫鍵。復(fù)性是一個(gè)很難捉摸的過(guò)程，不同蛋白的復(fù)性條件也各不相同。
5、包涵體復(fù)性問(wèn)題
包含體復(fù)性三大原則：
1。低濃度
2。平緩梯度
3。低溫
有蛋白析出最大的可能型是：蛋白濃度太高，建議你稀釋以后再作透析。
此外，透析的鹽濃度（比如ura）要平緩降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。
6、包涵體復(fù)性形成聚集物
關(guān)鍵是蛋白在復(fù)性過(guò)程中凝聚了以后，調(diào)節(jié)PH可以使其溶解，但是這樣復(fù)性好的蛋白有沒(méi)有活性還是問(wèn)題，雖然樣品溶解了，但活性不高或沒(méi)有也不行呀！
7、復(fù)性中蛋白析出！
出現(xiàn)蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復(fù)性應(yīng)該采取復(fù)性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據(jù)你包含體的溶液成分，每隔1個(gè)PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時(shí)必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。但是復(fù)性的比率應(yīng)該很低。
若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M；
另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復(fù)性樣品中也可加適量甘油；一些拙見(jiàn)。
8、包涵體復(fù)性液配方
對(duì)于包涵體復(fù)性，一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過(guò)程開(kāi)始，到2M 左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開(kāi)始，到1.5M 時(shí)復(fù)性過(guò)程已經(jīng)結(jié)束。TRIS系統(tǒng)和PBS系統(tǒng)都沒(méi)有明確的規(guī)定，這些需要你在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不斷試驗(yàn)，確定合適的緩沖系統(tǒng)；不過(guò)復(fù)性過(guò)程主要是注意以下幾個(gè)問(wèn)題：
1）最適pH值范圍為8.0-9.0之間；
2) 溫度適宜選擇4℃；
3）復(fù)性過(guò)程蛋白濃度不宜過(guò)大，一般為0.1-0.2mg/mL；
4) 復(fù)性時(shí)間一般為24-36小時(shí)；
5) 低分子化合物 如L-Arg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑，都可阻止蛋白聚集；Tris對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用；EDTA可以防止蛋白降解；
6) 氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。
還有就是你的蛋白質(zhì)的特性
9、什么叫復(fù)性成功
復(fù)性效果的檢測(cè)：
根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測(cè)。
1，凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測(cè)變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。
2，光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測(cè)，但一般只用于復(fù)性研究中的過(guò)程檢測(cè)。
3，色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同，
4，生物學(xué)活性及比活測(cè)定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測(cè)定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測(cè)活方法測(cè)得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。
5，黏度和濁度測(cè)定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見(jiàn)的沉淀析出。
6，免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。
在正常的生理?xiàng)l件下，組成蛋白質(zhì)的多肽鏈都能以獨(dú)特的方式進(jìn)行折疊，形成自己特有的空間結(jié)構(gòu)，以執(zhí)行某一些生命活動(dòng)。當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)，可能造成基因突變和蛋白質(zhì)序列改變，錯(cuò)誤剪接和運(yùn)輸，錯(cuò)誤折疊和異常聚積，形成對(duì)機(jī)體有害的反應(yīng)，引起構(gòu)象病的發(fā)生和無(wú)生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對(duì)包涵體形成和復(fù)性過(guò)程中發(fā)生聚集的機(jī)制尚不清楚，許多已建立的高效復(fù)性方法是在反復(fù)實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立的，且沒(méi)有普遍性，但從這許許多多的個(gè)例中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律：如聚集的發(fā)生是由鏈間的疏水相互作用介導(dǎo)、聚集具有相對(duì)特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，并利用這些知識(shí)建立了一些重組蛋白質(zhì)高效復(fù)興性的方法。相信隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)工程學(xué)及相關(guān)新技術(shù)和新設(shè)備的發(fā)展和完善，在不久的將來(lái)，預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)最佳復(fù)性方案將成為可能。
10、怎樣鑒定融合蛋白復(fù)性是否成功
問(wèn)：最近在做GST融合蛋白的純化，由于目的蛋白主要存在于包涵體中，所以在變性條件下將包涵體溶解，經(jīng)復(fù)性，透析后用GSH sepharose 4B純化，結(jié)果得到了比較純的融合蛋白，這是否說(shuō)明GST的活性已得到恢復(fù)（因?yàn)槟芘cGSH結(jié)合），請(qǐng)問(wèn)這種情況下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢復(fù)？由于我的目的蛋白只是一個(gè)蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什么受體之類的，所以不知如何鑒定它的活性。
如果我得到的是變性的融合蛋白，那么用于制備多抗或者單抗會(huì)有影響嗎？
如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B純化得到的融合蛋白可以直接用于制備多抗嗎？溶液中的GSH，Tis等成分對(duì)免疫動(dòng)物有影響嗎？是否需要透析除取這些成分才能去免疫動(dòng)物呢？
答：1）。不可以。GST 具體多大忘記了，但做為T(mén)AG 使用的蛋白一般是很小的一段AA，可以用相對(duì)應(yīng)的抗體做PULL DOWN，親和純化等。但蛋白的活性是需要構(gòu)象存在的，一小段TAG 空間結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有，就算是沒(méi)有恢復(fù)活性的蛋白也可以與這小段AA 對(duì)應(yīng)的抗體結(jié)合。
2）。變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產(chǎn)物，用來(lái)免疫動(dòng)物具有更強(qiáng)的抗原性。只是天然蛋白中被包在內(nèi)部的抗原決定簇也會(huì)暴露出來(lái)，如果用該變性抗原制備的抗體來(lái)檢測(cè)變性抗原是可以的，如果用來(lái)檢測(cè)天然蛋白，可能會(huì)有假陽(yáng)性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對(duì)抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部，是否能用還要看將來(lái)該單抗用來(lái)干什么。
3）。免疫動(dòng)物要求抗原體種盡量小。在這種小體積的情況下，緩沖液里的小分子成分只要沒(méi)毒影響就不大，可以不用考慮。
4） GST為26kd,你得到的蛋白活性應(yīng)通過(guò) 目的蛋白功能分析才能驗(yàn)證是否復(fù)性。GST融合蛋白可以免疫動(dòng)物，但抗體純化須用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G進(jìn)一步純化，去掉抗GST抗體，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去 ＧＳＴ，再免疫動(dòng)物.GSH,Tris 是小 分子，沒(méi)影響。
5） 既然目的蛋白沒(méi)有活性，何來(lái)得活性鑒定，復(fù)性是否成功，就主要是看是否恢復(fù)到原來(lái)特有的三級(jí)結(jié)構(gòu)，這就要看你目的蛋白的特異性，和天然的目的蛋白片斷進(jìn)行比較，看其復(fù)性是否徹底，這必須有個(gè)對(duì)照，才能知道復(fù)性是否完全。不知道你得到目的蛋白有什么用處，如果是用來(lái)做抗原，就沒(méi)有必要進(jìn)行活性鑒定了。
變性的融合蛋白做抗原是沒(méi)有影響的，gst的分子量是26kda，當(dāng)然，如果將融合伴侶除去，抗體的特異性會(huì)要更好一些，如果不除，影響也不會(huì)很大。最好進(jìn)行透析，除去溶液中的雜物質(zhì)，但是Tris沒(méi)有什么關(guān)系，其就如同PBS一樣，本身是緩沖體系，不會(huì)對(duì)免疫造成太大影響。
6） 做抗原的話，變性了沒(méi)關(guān)系的；純化后可以直接免疫動(dòng)物，我們這就有人做，不過(guò)他是用的His融合表達(dá)；掛著GST挺好的，不切也行，蛋白大些豈不是抗原性更強(qiáng)些
另外，你看沒(méi)看過(guò)菌液上清里的蛋白量？那里可能有許多的有活性的蛋白呀
五、包涵體的純化
復(fù)性以后的蛋白質(zhì)的純化策略與可溶性蛋白質(zhì)相似，這里不再贅述。（注：當(dāng)然也可以先純化然后再?gòu)?fù)性———一般多采用凝膠柱，或者純化與復(fù)性同步進(jìn)行———比如柱上復(fù)性。）
六、包涵體表達(dá)的蛋白的復(fù)性包涵體表達(dá)的蛋白的復(fù)性
包涵體：
包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無(wú)活性的固體顆粒。
包涵體的組成與特性：
一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。
包涵體的形成：
主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過(guò)程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的。
1、表達(dá)量過(guò)高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對(duì)，過(guò)多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等。
2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說(shuō)含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。
3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。
4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達(dá)分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵體表達(dá)的有利因素：
1、可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達(dá)可以避免蛋白酶對(duì)外源蛋白的降解。
2、降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達(dá)量的提高。
3、包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡(jiǎn)單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于分離純化。
4、對(duì)機(jī)械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細(xì)胞膜碎片分離。
破菌：
1、機(jī)械破碎
2、超聲破碎
3、化學(xué)方法破碎
分離：
1、離心：5000-20000g15min離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。
2、過(guò)濾或萃取方法：
洗滌：
由于脂體及部分破碎的細(xì)胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。
溶解：
常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍（GdnHCl6-8M），通過(guò)離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，異氰硫酸胍（GdnSCN）最強(qiáng)。
去垢劑：如強(qiáng)的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。問(wèn)題是由于SDS無(wú)法徹底的去除而不允許在制藥過(guò)程中使用。
極端pH：可以破壞蛋白的次級(jí)鍵從而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生長(zhǎng)激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。
變性劑的使用濃度和作用時(shí)間：一般在偏堿性性的環(huán)境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，一般不要超過(guò)pH1.0。有些蛋白只能用鹽酸胍如IL-4。增溶時(shí)一般室溫過(guò)夜，但鹽酸胍在37度1小時(shí)便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。
還原劑：
由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時(shí)一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文獻(xiàn)使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無(wú)關(guān)，而有些沒(méi)有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無(wú)影響，如牛生長(zhǎng)激素包涵體的增溶。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒(méi)有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。
復(fù)性：
通過(guò)緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過(guò)程開(kāi)始，到2M左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開(kāi)始，到1.5M 時(shí)復(fù)性過(guò)程已經(jīng)結(jié)束。
復(fù)性中常采用的方法有：
稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過(guò)夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。
透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過(guò)逐漸降低外透液濃度來(lái)控制變性劑去除速度，有人稱易形成沉淀，且不適合大規(guī)模操作，無(wú)法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。
超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對(duì)透析速度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過(guò)程中不可逆的變性。
柱上復(fù)性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法，如華北制藥的G-CSF復(fù)性據(jù)說(shuō)是通過(guò)柱上復(fù)性進(jìn)行的。常用于復(fù)性的層析方法有SEC、HIC等。
還原劑的去除：
還原劑一般和變性劑的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫鍵慢慢形成。但是由于二硫鍵的形成并不是蛋白質(zhì)正確折疊所必須的，可以考慮在變性劑完全去除之后，在去除還原劑使已經(jīng)按照正確的結(jié)構(gòu)相互接近的巰基間形成正確的二硫鍵。
常用的氧化方法有：
空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，或者加入二價(jià)銅離子，能夠取得更好的效果，缺點(diǎn)是不易控制氧化還原電勢(shì)。
氧化還原電對(duì)（redox）：常采用GSSG/GSH，通過(guò)調(diào)整兩者的比例來(lái)控制較精確的氧化還原電勢(shì)，也可以在添加了還原劑如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。
復(fù)性的效率：
復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過(guò)程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL-11，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點(diǎn)幾。一般說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢(shì)、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。
復(fù)性過(guò)程的添加劑：
1、共溶劑：如PEG6000-20000，據(jù)說(shuō)可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團(tuán)，此外由于阻止了蛋白質(zhì)分子間的相互接觸的機(jī)會(huì)，也可能對(duì)復(fù)性效率的提高起作用。一般的使用濃度在0.1%左右，具體條件可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件確定。
2、二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）和脯氨酸異構(gòu)酶（PPI）：PDI可以使錯(cuò)配的二硫鍵打開(kāi)并重新組合，從而有利于恢復(fù)到正常的結(jié)構(gòu)，此外在復(fù)性過(guò)程中蛋白質(zhì)的脯氨酸兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變需要較高能量，常常是復(fù)性過(guò)程中的限速步驟，而PPI的作用是促進(jìn)兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)復(fù)性的進(jìn)行。
3、分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒(méi)有蛋白質(zhì)特異性的促進(jìn)折疊的蛋白因子，研究發(fā)現(xiàn)很多蛋白在缺乏分子伴侶時(shí)無(wú)法自己正確的折疊。有人構(gòu)建了與伴侶分子共同表達(dá)的菌株，據(jù)說(shuō)效果不錯(cuò)。不過(guò)在生產(chǎn)中還沒(méi)有看到2和3的應(yīng)用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的應(yīng)用于很多蛋白如t-PA的復(fù)性中，可以抑制二聚體的形成。
5、甘油等：增加黏度，減少分子碰撞機(jī)會(huì)，一般使用濃度在%5-30%。
6、一定的鹽濃度，可能是為了降低某些帶電集團(tuán)間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊。
7、輔助因子：添加蛋白質(zhì)活性狀態(tài)必須的輔助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等很多時(shí)候?qū)Φ鞍踪|(zhì)正確的折疊是有利的。
8、色譜法：通過(guò)將目標(biāo)蛋白結(jié)合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，該方法得到越來(lái)越多的應(yīng)用，常用的色譜有SEC、HIC、IEC、IMAC等。
當(dāng)然，雖然有很多所謂的理性的復(fù)性方案設(shè)計(jì)，目前的復(fù)性工作更多的是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)的過(guò)程，沒(méi)有一種通用的方法可以套用。
復(fù)性時(shí)的蛋白濃度：
一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟(jì)，而且很多蛋白在低濃度時(shí)不穩(wěn)定，很容易變性。
復(fù)性效果的檢測(cè)：
根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測(cè)。
1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測(cè)變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。
2、光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測(cè)，但一般只用于復(fù)性研究中的過(guò)程檢測(cè)。
3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。
4、生物學(xué)活性及比活測(cè)定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測(cè)定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測(cè)活方法測(cè)得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。
5、黏度和濁度測(cè)定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見(jiàn)的沉淀析出。
6、免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。
幾個(gè)復(fù)性的實(shí)例：
1、MHCII JBC 269（47）：1994
增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.
復(fù)性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.
2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.
復(fù)性：10倍稀釋到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.對(duì)起始緩沖液密閉透析16hr，開(kāi)口透析8hr，對(duì)150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。
3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四對(duì)二硫鍵。
增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.
復(fù)性：稀釋到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.對(duì)4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，溫度4度。
純化：
一般說(shuō)來(lái)，復(fù)性液的體積較大，為了減少處理體積，在進(jìn)行柱純化以前可以先進(jìn)行硫酸銨沉淀，沉淀在低速離心收集后復(fù)溶的鹽濃度較高，可以直接進(jìn)行HIC純化，目標(biāo)峰經(jīng)適當(dāng)稀釋后（cond<5mS/cm）進(jìn)行IEX純化，然后通過(guò)SEC脫鹽，更換緩沖液，除菌過(guò)濾后，在質(zhì)量合格的情況下便可以進(jìn)入制劑階段。
當(dāng)然在復(fù)性濃度較高的情況下，也可以直接將復(fù)性液進(jìn)行IEX純化，優(yōu)點(diǎn)是在純化的同時(shí)進(jìn)行體積的濃縮，為以后的精制創(chuàng)造條件。
從生產(chǎn)的角度看，由于每增加一步純化工序便降低很多收率，所以可過(guò)兩到三次柱純化，工藝越簡(jiǎn)單越有利于收率的提高。當(dāng)然這只是一個(gè)一般的原則，對(duì)于純度要求較高的產(chǎn)品如重組人白蛋白，不得不進(jìn)行多次純化。
