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cDNA第二鏈的合成

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-07-01
1)離心沉淀cDNA第一鏈,并重懸在50μl水中,加50μl 2×第二鏈緩沖液(0.2mol/L Hepes,pH6.9,20m mol/L MgCl2,5 m mol/L DTT,0.14 mol/L KCl,1 m mol/L 4種Dntp),混合均勻。
2)每微克底物加大腸桿菌DNA聚合酶K1enow片段20~50單位,15℃反應20小時,此酶能識別cDNA 3’末端發卡環,并以其為引物,cDNA第一鏈為模板,開始第二鏈的合成。
3)加0.5 mol/L EDTA 2μl終止反應。取樣電泳,以提取第一鏈同樣的方法分離沉淀dsDNA。
對于這樣合成的dsDNA不是全長的DNA分子,所以,需要進一步用逆轉錄酶合成。
4)溶解上述dsDNA在20μl水中,再加入:1mol/L Tris.HCl pH8.3)5μl,1 mol/L KCl 7μl,250m mol/L MgCl2 2μl,20m mol/L 4種‘dNTP各2.5μl,700m mol/L β-MCE 2μl,加重煎水到48μl,加逆轉錄酶2μl (40單位)、42℃保溫反應1小時。
5)加0.5 mol/L EDTA 2μl終止反應,取樣電泳,以同樣方法抽提,分離沉淀dsDNA。
6)用兩次合成的雙鏈cDNA和單鏈cDNA在1.4%堿性瓊脂糖凝膠上電泳,放射自顯影后觀察,如果dsDNA片段的長度是第一鏈cDNA的兩倍,那么,合成便是成功的。
7)用核酸酶S1消化dsDNA,除去連接兩條鏈的發卡環。
 
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