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代表性差示分析(RAD)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

代表性差示分析(RAD)充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈模板,而以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性,通過消減和富集,使得目的基因片段得到特異性擴(kuò)增。將待測cDNA (Tester)和驅(qū)動(dòng)cDNA (Driver)分別用同一種識別4堿基序列的限制性內(nèi)切酶切割,形成的平均長度為256bp的cDNA片段代表群,保證了絕大多數(shù)遺傳信息均能被PCR擴(kuò)增;分別接上寡聚核苷酸接頭(adaptor),并以接頭為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,此步將大小不等的DNA片段分離純化;將接頭切除,并只在Tester片斷末端接上新接頭,然后將Tester與大大過量的Driver混合雜交。Driver過量的目的是使T群體中特異性序列沒有遺漏的可能;復(fù)性,補(bǔ)平末端,并以新接頭為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,形成的3種雜和體中只有自身退火形成的Tester / Tester兩端均能和引物配對,產(chǎn)物雙鏈DNA數(shù)量呈指數(shù)遞增。Tester / Driver雜交體只能是單引物擴(kuò)增,產(chǎn)物為單鏈DNA分子,其數(shù)量呈線性遞增。Driver/ Driver雜和體由于分子兩端沒有與新引物配對區(qū)而無法進(jìn)行擴(kuò)增;用Mung Bean Nuclease去除單鏈DNA分子,差異雙鏈cDNA便完成第一輪富集。實(shí)驗(yàn)中使用過量Driver DNA目的是充分使Tester DNA中和Driver DNA序列相同的片段雜交,酶解去除,只有差異雙鏈差異cDNA經(jīng)PCR幾輪循環(huán)得以有效富集。

代表性差示分析(RAD)優(yōu)點(diǎn)可以概括為以下幾個(gè)方面:
(1)引物設(shè)計(jì)十分巧妙
(2)可重復(fù)性好
(3)假陽性少
(4)mRNA用量少、特異性高
其缺點(diǎn)為:
(1)Tester組低豐度的分子自身雜交的幾率很低,所以被擴(kuò)增和克隆的幾率仍很低;
(2)酶切連接步驟太多,cDNA會(huì)損失很多,所以可能漏掉關(guān)鍵基因;
(3)得到的不是cDNA全長而是其酶切片段。

 

 
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