在线观看亚洲精品专区-在线观看亚洲免费-在线观看亚洲免费视频-在线观看亚洲欧美-欧美freexxx-欧美free嫩交video

VIP標識 上網做生意,首選VIP會員| 設為首頁| 加入桌面| | 手機版| RSS訂閱
食品伙伴網服務號
 

PCR反應五要素

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-07-01

1、引物
引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則:
 、僖镩L度: 15-30bp,常用為20bp左右。
  ②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
 、垡飰A基:G C含量以40-60%為宜,G C太少擴增效果不佳,G C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
  ④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3’端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。
 、菀3’端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
  ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處。
 、咭锏奶禺愋裕阂飸c核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。

  引物量: 每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
  
2、酶
 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應, 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少。
  
3、dNTP
 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0~7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中,dNTP應為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2 結合,使游離的Mg2 濃度降低。

4、模板

  模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環節之一,傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是:溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質結合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

5、Mg2 濃度
 Mg2 對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響,在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2 濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2 濃度過高,反應特異性降低,出現非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產物減少。
PCR反應條件的選擇

 
[ 網刊訂閱 ]  [ 食品專題搜索 ]  [ ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 關閉窗口 ] [ 返回頂部 ]

 

 
推薦圖文
推薦食品專題
點擊排行
 
 
Processed in 0.157 second(s), 19 queries, Memory 0.88 M
主站蜘蛛池模板: 一级女性黄 色生活片 | 99热网址| 中文字幕亚洲一区 | 美女被免费网站视频在线 | 操女人视频网站 | 国产产一区二区三区久久毛片国语 | 亚洲a成人| 五月婷婷免费视频 | 天堂网www在线资源网 | 最新国产在线播放 | 特级全黄大片 | 狠狠色丁香婷婷综合久久来 | 狠狠狠色丁香婷婷综合久久88 | 午夜免费视频网站 | 最新日本免费一区二区三区中文 | 噜噜色噜噜色 | 天天爽夜夜爽天天做夜夜做 | 色免费网站 | www.三级| 国模吧一区二区三区精品视频 | 亚洲影视久久 | 在线观看h网站 | 日本黄色美女网站 | 青草青草视频2免费观看 | 天堂网欧美 | 五月婷婷亚洲综合 | 三级黄色片免费观看 | 亚洲成色999久久网站 | 二区在线播放 | 欧美在线一级视频 | 成人免费的性色视频 | 人人干在线观看 | 成人免费看黄页网址大全 | 农村女人的一级毛片 | 加勒比黑人喝羽月希奶水 | 欧美影院入口 | 真实子伦视频不卡 | 手机看片国产精品 | 国产视频资源 | 欧美成网站 | 天天干天天曰天天操 |