在线观看亚洲精品专区-在线观看亚洲免费-在线观看亚洲免费视频-在线观看亚洲欧美-欧美freexxx-欧美free嫩交video

VIP標識 上網做生意,首選VIP會員| 設為首頁| 加入桌面| | 手機版| RSS訂閱
食品伙伴網服務號
 

PCR反應五要素

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-07-01

1、引物
引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則:
 、僖镩L度: 15-30bp,常用為20bp左右。
  ②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
 、垡飰A基:G C含量以40-60%為宜,G C太少擴增效果不佳,G C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
  ④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3’端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。
 、菀3’端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
  ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處。
 、咭锏奶禺愋裕阂飸c核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。

  引物量: 每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
  
2、酶
 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應, 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少。
  
3、dNTP
 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0~7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中,dNTP應為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2 結合,使游離的Mg2 濃度降低。

4、模板

  模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環節之一,傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是:溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質結合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

5、Mg2 濃度
 Mg2 對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響,在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2 濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2 濃度過高,反應特異性降低,出現非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產物減少。
PCR反應條件的選擇

 
[ 網刊訂閱 ]  [ 食品專題搜索 ]  [ ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 關閉窗口 ] [ 返回頂部 ]

 

 
推薦圖文
推薦食品專題
點擊排行
 
 
Processed in 0.157 second(s), 19 queries, Memory 0.88 M
主站蜘蛛池模板: 日本高清视频色www在线观看 | avtom影院永久转四虎入口 | 欧美亚洲天堂网 | 久久久久女人精品毛片九一 | 精品色图 | 五月综合激情视频在线观看 | 色婷婷免费视频 | 国产激情电影综合在线看 | 午夜情趣视频 | av免费网站在线观看 | 午夜影院在线视频 | 色偷偷免费 | 人人爱人人爽 | 国产一区二区三区波多野吉衣 | 午夜免费理论片在线看 | 爱情社保片鲁丝片一区 | 91热成人精品国产免费 | 窝窝午夜看片 | 国产精品片 | 成人a毛片在线看免费全部播放 | 亚洲第一区精品日韩在线播放 | 中国一级特黄特色真人毛片 | 淫操| 欧美成人全部免费观看1314色 | 日本系列 1页 亚洲系列 | 日本a级三级三级三级久久 日本a级影院 | 综合一个色 | 美国一级毛片免费看成人 | 综合色久七七综合七七蜜芽 | 377p亚洲欧洲日本大胆色噜噜 | 久久福利影视 | 亚洲精品一卡2卡3卡三卡四卡 | 一区二区免费播放 | 手机看片福利日韩国产 | 免费一级在线观看 | 波多久久夜色精品国产 | 五月天毛片 | 综合色中色 | 躁天天躁中文字幕在线 | 色狠狠色综合久久8狠狠色 色狠狠网 | 国产女人小便视频 |