在聚丙烯管中可以對多種含膜板材料進行PCR,而在顯微玻片上用組織細胞涂片或切片直接進行DNA擴增的方法就稱為玻片PCR(Slide-PCR)。
先將細胞涂片或呈單層細胞,然后用甲醇/醋酸(3:1,V/V)、Carnoy溶液、無水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5~15min。用蒸餾水沖洗,干燥,直接使用或保存于-20℃?zhèn)溆谩T诓F蟿?0mm×28mm為免疫組化反應區(qū)。加入30μl PCR反應混合液,其中含10mmol/L Tris pH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/l dNTPs,100nmol/L引物,0.01%(V/V)明膠,0.2% BSA, 2.5u/100μl Taq酶。然后蓋上22mm×40mm的蓋玻片,邊緣用石蠟油封好。把玻片放入PCR熱循環(huán)儀金屬塊上,使金屬塊與樣品呈最大程度接觸,同在聚丙烯管中一樣,進行30~40個循環(huán)。對于較短的擴增片段在后期循環(huán)中變性溫度可降低。反應后,將致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蠟油,但不取出蓋玻片,用一個尖鑷子輕輕拈起蓋玻片一角,在相對的一角中PCR反應混合液呈半月形液面,用移液器回收。一般可回收25μl混合液,將反應產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳或用套式PCR引物按標準PCR進行重新擴增。片上擴增物可做原位雜交顯示。
在Slide-PCR中,需0.1%~1%的BSA。加入BSA可以保證擴增結(jié)果,但效率不一定很高。明膠(至少0.0001%),對擴增1kb左右的靶DNA十分重要。但對小片段擴增結(jié)果影響不大。不同的樣品提取方法或固定法對Slide-PCR都可行。
Silde-PCR的機理可能是在起始變性過程中一部分DNA從細胞中洗提出來,然后在細胞和玻片的水相中進行PCR。用地高辛標記的人全基因組DNA探針雜交表明在起始循環(huán)中DNA極微量,而30個循環(huán)后很豐富。常規(guī)細胞染色表明只有少量的形態(tài)改變。
Silde-PCR對于玻片上的細胞樣品提供了一種較好的方法,而不必再把這些樣品從玻片上括下來,使操作簡便,污染減少。本方法對于原樣品量極微且需病史追蹤保存的(如子宮頸涂片或涂片)具有實用價值。
先將細胞涂片或呈單層細胞,然后用甲醇/醋酸(3:1,V/V)、Carnoy溶液、無水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5~15min。用蒸餾水沖洗,干燥,直接使用或保存于-20℃?zhèn)溆谩T诓F蟿?0mm×28mm為免疫組化反應區(qū)。加入30μl PCR反應混合液,其中含10mmol/L Tris pH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/l dNTPs,100nmol/L引物,0.01%(V/V)明膠,0.2% BSA, 2.5u/100μl Taq酶。然后蓋上22mm×40mm的蓋玻片,邊緣用石蠟油封好。把玻片放入PCR熱循環(huán)儀金屬塊上,使金屬塊與樣品呈最大程度接觸,同在聚丙烯管中一樣,進行30~40個循環(huán)。對于較短的擴增片段在后期循環(huán)中變性溫度可降低。反應后,將致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蠟油,但不取出蓋玻片,用一個尖鑷子輕輕拈起蓋玻片一角,在相對的一角中PCR反應混合液呈半月形液面,用移液器回收。一般可回收25μl混合液,將反應產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳或用套式PCR引物按標準PCR進行重新擴增。片上擴增物可做原位雜交顯示。
在Slide-PCR中,需0.1%~1%的BSA。加入BSA可以保證擴增結(jié)果,但效率不一定很高。明膠(至少0.0001%),對擴增1kb左右的靶DNA十分重要。但對小片段擴增結(jié)果影響不大。不同的樣品提取方法或固定法對Slide-PCR都可行。
Silde-PCR的機理可能是在起始變性過程中一部分DNA從細胞中洗提出來,然后在細胞和玻片的水相中進行PCR。用地高辛標記的人全基因組DNA探針雜交表明在起始循環(huán)中DNA極微量,而30個循環(huán)后很豐富。常規(guī)細胞染色表明只有少量的形態(tài)改變。
Silde-PCR對于玻片上的細胞樣品提供了一種較好的方法,而不必再把這些樣品從玻片上括下來,使操作簡便,污染減少。本方法對于原樣品量極微且需病史追蹤保存的(如子宮頸涂片或涂片)具有實用價值。