1．DNA的變性　DNA變性解鏈是雜交成功的關鍵。Southern印跡雜交時DNA在凝膠中變性，變性方法是將凝膠浸在數倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用數倍體積的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發生變性，但強酸會使核酸降解。一般認為堿變性較好，可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度（100μg/ml）和低鹽濃度（0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0）下進行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml,加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8），室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4調pH到7～8[亦可用堿變性后，調至中性，再加熱100。c 10min]，DNA變懷可用OD260增加（約30%～40%）來檢測，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。

　　2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定　硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45μm）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min～2h，涼干。DNA樣品轉移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后在80。C真空干燥2h。

　　3．預雜交　濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米濾膜加0.2ml預熱至60。C的預雜交液（6×SSC，0.5%,SDS,5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調濃度至10mg/ml，用前放100。C水浴中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68。C水浴保溫3~12h。當預雜交液溫度升至68。C時，在濾膜表面常會形成小氣泡。輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預雜交液很重要。

　　4．雜交　從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤（50μl/cm2）。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/l EDTA, 變性的標記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS, 100μg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴密封口，雜交反應在68℃水浴中進行，所需時間視探針和檢測靶DNA的性質及探針的比活性等情況而定，一般4～20h。

　　5．洗膜　取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤中，室溫下漂洗5min。再將濾膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室溫下洗滌15min（輕輕搖動）。然后將濾膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃輕輕搖動保溫2h，更換緩沖液后繼續保溫30min。

　　洗膜的溫度一般應控制在低于Tm值12℃以上。（Tm = 69.3 0.41x(G C) %）。雙鏈DNA的Tm值隨錯配堿基對數每增加1%而遞減1℃。

　　6．結果顯示　固相膜的放射性雜交結果顯示有兩種方式，一是放射性自顯影法，另一種是液閃計數法。前一種方法比較簡單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中曝光數小時至數天，再顯影、定影即可。對于雜交信號較弱的固相膜，用一塊增感屏可顯著增強曝光強度。此外，為了減弱32P的散射，曝光通常在-20℃或-80℃下進行。液閃計數法主要用于打點和狹縫雜交及為了比較兩個雜交信號的強弱等情形。方法是將完成雜交的膜在漂洗結束后剪成小塊（每份樣品1塊），80℃真空干燥后裝閃爍瓶。加入2～5ml閃爍液，剪2～3塊無樣品膜塊作為本底對照。在液體閃爍計數器上自動計數。液體計數測定放射性強度也可在放射自顯影之后進行。