（一）基本原理
混合樣品的氣流通過(guò)固定相時(shí)，根據(jù)各組分對(duì)固定相的吸附強(qiáng)弱不同使不同成分得到分離。
利用氣相色譜層析技術(shù)做為微生物診斷的工具已成功地用于微生物的分類(lèi)和鑒定。該法敏感性強(qiáng)，能夠分離和檢測(cè)到毫微克的水平。它具有快速的特點(diǎn)，常在數(shù)十分鐘甚至數(shù)小時(shí)就可以對(duì)傳染病做出早期診斷。其結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，但不足之處是操作中各因素不易控制，方法不易標(biāo)化等。
（二）氣相色譜儀的基本部件
1． 載氣 常用的載氣主要有氮、氬、氫和二氧化碳等。這些氣體一般都由高壓氣瓶供給。
2． 進(jìn)樣器 氣相色譜儀可以用于分離固相、氣相和液相標(biāo)本。液相標(biāo)本采用微升注射器穿過(guò)橡皮隔片注入，氣相標(biāo)本采用特種氣相注射器注入。
3． 譜柱及加熱爐 色譜柱一般由金屬或玻璃制成，通常采用的柱長(zhǎng)2m~4m，內(nèi)徑2mm, 毛細(xì)管柱長(zhǎng)度可達(dá)20m～150m，內(nèi)徑為0.2mm。
載體一般采用惰性、多孔的固體顆粒。多由硅藻土或玻璃珠制成，分析不同極性的微生物化合物，為了獲得最適的分離條件，要求有不同固定相的載體。目前比較常用的載體有：聚乙二醇（CarbOwax 20M）、F F A P（聚乙二醇20M和2-硝基對(duì)苯二甲酸的反應(yīng)產(chǎn)物），OV—17（苯基甲基硅酮）。OV-210、SE-30（甲基硅酮）、Chromosorb G（白色硅藻土載體）等。柱加熱爐在溫度控制上是非常重要的。
4． 紀(jì)錄儀
5． 數(shù)據(jù)處理裝置 一般均附有數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)。
（三）試驗(yàn)條件的選擇
1． 色譜柱的選擇 要注意極性及最高使用溫度，柱溫不能超過(guò)最高使用溫度。固定相按極性相似的原則選擇。
色譜柱的內(nèi)徑大小、長(zhǎng)度都能影響分離率。一般而言，內(nèi)徑越小，長(zhǎng)度越長(zhǎng)，分離效果越好，一般柱長(zhǎng)為1m～5m（毛細(xì)管柱則20m～100m）。
填充劑顆粒一般采用40目～60目，60目～80目及80目～100目大小。長(zhǎng)柱子宜用粒度大些的，以減少柱壓降，短柱子則用粒度細(xì)的。
氣相色譜中固定液的含量對(duì)分離效率的影響較大。一般采用固定液與載體重量之比為15︰100～25︰100。采用高靈敏度的檢測(cè)器，由于進(jìn)樣量減少，固定液含量可以降至5︰100以下。這樣可以使用較低柱溫，從而提高柱效，縮短分析時(shí)間。但固定液用量太少會(huì)引起吸附。
2．柱溫選擇 柱溫選擇對(duì)分離度影響很大，常是條件選擇的關(guān)鍵。選擇的基本原則是：在使最難分離的組分有盡可能好的分離高度的前提下，盡可能采取較低溫度，但以保留時(shí)間適宜及不拖尾為度。
⑴ 高沸點(diǎn)混合物（200℃～400℃），若需在較低的柱溫下分析，可采用低固定液配比1％～3%，采用高靈敏檢測(cè)器，柱溫可比沸點(diǎn)低100℃～150℃，在200℃～250℃的柱溫下分析。
⑵ 沸點(diǎn)＜300℃的樣品，可用3％～25%固定液配比。沸點(diǎn)越低，所用配比越高，柱溫可比平均沸點(diǎn)低50℃至平均沸點(diǎn)的范圍選擇。
3．載體選擇 載體采用低線速時(shí)，宜用氮?dú)猓桓呔�速時(shí)用氫氣。柱越長(zhǎng)，柱內(nèi)有較大壓力降，宜用氫氣。載氣采用低線速時(shí)為20ml～80ml/min。
4．其它條件
⑴ 氣化室溫度及檢測(cè)室溫度選擇：氣化溫度取決于樣品的揮發(fā)性、沸點(diǎn)、穩(wěn)定性以及進(jìn)樣量，一般選擇稍高于樣品沸點(diǎn)，但不要超過(guò)沸點(diǎn)50%以上，以防分解。檢測(cè)室溫度需高于柱溫，一般高于柱溫30℃左右或與氣化室同溫。
⑵ 進(jìn)樣量：固定相在配比15％～35%的層析柱時(shí)，最大進(jìn)樣量液體為10μl，氣體為10ml。一般樣品量液體4μl，氣體為0.5ml～3ml，固體小于1mg。
⑶ 橋電位選擇：散熱多和選擇大的橋電位，在靈敏度相同的情況下，應(yīng)盡量選擇低橋電位，以保護(hù)熱敏元件。
（四）填充柱的制備
1．稱(chēng)取一定量的載體于蒸發(fā)皿中，加2倍于載體體積的低沸點(diǎn)溶劑（氯仿丙酮、三氯甲烷等），使之溶解。
2．取適量的固定液，倒入蒸發(fā)皿中，拌勻。注意應(yīng)使載體全部覆蓋在液面下，于紅外燈下緩緩加熱，不時(shí)輕輕攪拌，待溶液全部揮發(fā)。
3．先將柱的一端用玻璃毛輕輕堵上，接上吸濾真空泵，柱的另一端接上漏斗，將填充劑從漏斗加入，同時(shí)啟動(dòng)真空泵，不時(shí)輕敲柱子各部，以使填充均勻。裝滿后，關(guān)閉真空泵，取下色譜柱，將加樣的一端也填上一小團(tuán)玻璃毛。
4．將柱裝入色譜柱中，在通載氣前，先將爐溫升至略高于操作溫度，保持約1h，以使固定液受熱熔化或粘度減小，在載體表面流布均勻，然后再通入載氣，使色譜柱在操作溫度下，通載氣數(shù)小時(shí)。
（五）樣品處理
以細(xì)菌培養(yǎng)物樣品的處理為例。
1．取3～5個(gè)菌落，接種于2ml含有3%葡萄糖TSB肉湯（即含胰酶1.42%、植物胨 0.25%、K2H PO4 0.25%NaCl、0.42%的肉湯）內(nèi)，35℃～38℃培養(yǎng)3h。
2．于培養(yǎng)物中加2ml 5Mol/L H2SO4、H2O和CH3OH（1︰3︰16），混合后，再加4ml醋酸乙脂浸取，混勻，靜置片刻。
3．4 000r/min離心15min，棄沉淀。
4．取上清液加等量乙醚提取，收集乙醚層。
5．于水層中再加上述比例的5 Mol/L H2 SO4、H2O和CH3OH混合物。
6．于混合物中加等量氯仿提取，分層，收集氯仿層，棄去水層。
7．將乙醚層與氯仿層合并，揮發(fā)濃縮至0.01ml,加10μg已二酸作內(nèi)標(biāo)物，再加20μg甲氯基胺－HCl。
8．于混合物中加0.2ml吡啶，再加0.2ml TRI－SIL－BSA和0.05ml TMOS，混勻，60℃孵育1h，離心，去沉淀。
9．上清即可制譜。
（六）操作方法
1．按流程圖并參考儀器使用說(shuō)明書(shū)，將有關(guān)設(shè)備安裝好，檢查各系統(tǒng)各接頭是否漏氣，確定無(wú)誤后，可開(kāi)始操作。
2．打開(kāi)氣流總閥門(mén)，調(diào)節(jié)表頭上的減壓閥，使氣體壓力為22kg/cm2左右，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓器針形閥，使載氣流速控制在所需要的流速值。
3．加熱色譜柱至所需的柱溫并控制此溫（根據(jù)儀器恒溫箱的性能控制溫度波動(dòng)值在一定的范圍之內(nèi)，如±0.5℃）。一般所用的柱溫是在被分析物質(zhì)的平均沸點(diǎn)左右或更低一些。若被分析物的沸程太寬，則可用程序升溫法來(lái)升高柱溫。
4．加熱進(jìn)樣器（氣化室），使溫度高于樣品沸點(diǎn)的最高組分的沸點(diǎn)。
5．加熱檢測(cè)器恒溫箱，使溫度與柱溫一樣或高于一定的值。
6．氣流和溫度均達(dá)穩(wěn)定后，給檢測(cè)器通電流。若采用氫火焰離子化檢測(cè)器則啟動(dòng)微電流放大器部分。
7．調(diào)檢樣器為零點(diǎn)，待穩(wěn)定后，即可開(kāi)始進(jìn)樣。
（七）結(jié)果分析
氣相色譜層析是一種分離分析的方法，因此它的特點(diǎn)是適合于多組分混合物的定性和定量分析。
1．定性 對(duì)于一已知范圍的混合物，用此法定性很容易，但對(duì)于范圍未知的混合物來(lái)說(shuō)，則需要配合化學(xué)分析及其它儀器分析等。
⑴ 利用保留值定性法：同一種物質(zhì)在一根層析柱上保留時(shí)間相同。取樣品各可能組分的純物質(zhì)加入樣品中，混合進(jìn)樣，對(duì)此加入后的色譜圖，若某色譜峰相對(duì)譜高，則該色譜峰的組分與純物質(zhì)可能為同一物質(zhì)。
⑵ 化學(xué)反應(yīng)定性法：即把色譜柱的流出物，通過(guò)官能團(tuán)試劑中，觀察試劑的顏色是否發(fā)生變化或是否有沉淀，而判斷該組分含什么官能團(tuán)或?qū)儆诤晤?lèi)化合物。
⑶ 兩譜聯(lián)用定性法：即利用質(zhì)譜儀、紅外分光光度計(jì)等來(lái)進(jìn)行測(cè)定，定性。
2．定量 在實(shí)驗(yàn)條件恒定時(shí)，峰面積或峰高與組分的含量成正比，因此可以利用峰面積或峰高面積或峰高來(lái)進(jìn)行定量。對(duì)于微生物標(biāo)本的氣相色譜分析常根據(jù)以下幾點(diǎn)來(lái)進(jìn)行比較。
⑴ 峰的有無(wú)和峰的大小。
⑵ 按10個(gè)重復(fù)標(biāo)本分析計(jì)算的平均t值（標(biāo)準(zhǔn)差）。
⑶ 同標(biāo)準(zhǔn)化合物的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，而對(duì)某化合物做出鑒定。
