越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs)來抑制特定的哺乳動物基因表達(dá)。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）。RNAi的應(yīng)用包括功能基因組學(xué)，藥物靶篩選，細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路分析等等。

目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括

化學(xué)合成
體外轉(zhuǎn)錄
長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
siRNA表達(dá)載體或者病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAs
PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)

前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經(jīng)過轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞后面兩種方法則依賴能夠表達(dá)siRNAs的DNA載體或者表達(dá)框轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。哪種是最好的方法，其實(shí)取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹＿@里簡單介紹這5種方法，優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，以及它們最適合的應(yīng)用。

siRNA的設(shè)計(jì)
除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨(dú)設(shè)計(jì)siRNA序列。關(guān)于怎樣設(shè)計(jì)siRNA以及siRNA設(shè)計(jì)對siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來越多有關(guān)設(shè)計(jì)原則的信息。但這仍然不是精確的。通常來說，每個目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3—4對siRNAs，在后面的實(shí)驗(yàn)中選擇最有效的那個。網(wǎng)上有提供免費(fèi)的siRNA設(shè)計(jì)工具。

體外制備

1.化學(xué)合成
盡管化學(xué)合成是最貴的方法，但是卻是最方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。

最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究
不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素

2.體外轉(zhuǎn)錄
通過體外轉(zhuǎn)錄的方法可以合成siRNAs，這樣的成本相對化學(xué)合成法而言比較低，是一種性價比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。以Silencer siRNA Construction Kit為例，一旦得到DNA Oligo模版（這個還是需要DNA合成的，不過DNA合成的成本就比較低了），只要24小時就可以，不需要等很久。這個方法的不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r間——畢竟，化學(xué)合成只需要定購就可以了。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNAs較高濃度得到的效果（0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection）

最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價格成為障礙時。
不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。

3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA
其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。這個方法是選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一眾siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因。現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造成影響。Ambion公司曾經(jīng)用它的Silencer siRNA Cocktail Kit(RNase III)試劑盒成功關(guān)閉幾個基因，包括c-fos, GAPDH, La, ß-actin, 和Ku-70。

最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個基因功能缺失的表型
不適用于：長時間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療

體內(nèi)表達(dá)
前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA。

4. siRNA表達(dá)載體
多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴3種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)(1–4)。這3類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾天的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。不過幸好載體容易大量擴(kuò)增，這個優(yōu)點(diǎn)足以彌補(bǔ)所有缺陷，特別是當(dāng)載體在實(shí)驗(yàn)中確實(shí)有效的時候。
毫無疑問，siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于這是眾多方法中唯一可以進(jìn)行長期研究的方法——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。即使是對轉(zhuǎn)染帶有篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行瞬時篩選，也有助于富集帶質(zhì)粒的細(xì)胞。這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問題。
最近多個廠家開始研究逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便。

最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達(dá)siRNA的細(xì)胞。長期研究。
不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個克隆和測序等較為費(fèi)時、繁瑣的工作）

5. siRNA表達(dá)框架
siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。這個方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用，包括一個RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNA pol III終止位點(diǎn)。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費(fèi)時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配！如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長效抑制的研究。
這個方法的主要缺點(diǎn)是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。如果有適合的新型轉(zhuǎn)染試劑能提高SEC的轉(zhuǎn)染效率的話，那問題就可以解決了。另外，沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規(guī)模制備。
Silencer Express siRNA Expression Cassette Kits提供人源和鼠源的U6啟動子或者人源H1啟動子元件可供選擇，并已經(jīng)過c-fos基因抑制的檢驗(yàn)。

最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子
不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）

小結(jié)
運(yùn)用RNAi來誘導(dǎo)基因表達(dá)的沉默是一種制備基因功能缺失表型的有效的新方法。