作分子生物學實驗,核酸純化、酶切、克隆算是最基本的步驟了。因為要做定向克隆,通常要作雙酶切。為了省時省事兒,我們常常想方設法把兩個酶放在一起切。可是事情并非總那么稱心如意——兩個酶經常在一起鬧別扭,不是反應溫度不同啦,就是Buffer不同,有時候兩個酶切位點連在一起,必須先切一個再切另一個,否則就切不動——因為有的酶除了識別位點之外還需要旁邊留有幾個堿基,如果正好被切掉了就出問題。于是有人就到處找通用Buffer——其實所謂通用Buffer也只勉強適用于少數幾個常用酶,而且往往會出現不是最佳反應條件的問題、星號活力問題——想想看,酶在生物體內精密調控各種反應,不是最適條件當然容易出問題——馬虎一下有時就會有莫名其妙的結果,該切的切不動,不該切的切掉了,該連接的連不上,倒霉上一次就能浪費你幾個月時間。于是我們一股腦的怨:酶有問題。可是如果兩個酶分別切吧,費時間不說,切完一個,還要純化好半天——就是不跑電泳也得酚氯仿抽提,本來就不多的樣品這么一折騰,夠嗆。幸好如今有了試劑盒,一切都簡單了。您別說,這試劑盒雖然花錢,原理也簡單,可是用起來就是方便。第一次酶切后,只要5、6分鐘可以很方便地快速純化酶切樣,不用酚抽不用乙醇沉淀,就可以進行第二次酶切,保證最佳反應條件,又何必煞費苦心的作雙酶切呢,還可以減少一些人為的錯誤了。
MinElute DNA純化技術是基于一種特殊的、叫做Silica-gel-menbrane的膜,能夠在高鹽濃度的條件下迅速吸附DNA,在低鹽或者純水條件下釋放DNA,只要短短幾分鐘,就能徹底除去包括引物、核苷酸、酶、礦物油、鹽、瓊脂糖、EB以及其它雜質,和以前QIAGEN的Silica-gel-menbrane有所不同的是,它要求的洗脫體積非常小,只要10微升,純化的DNA是高度濃縮的,方便進行以后的反應。回收率在80%以上。
反應步驟非常簡單,只要將Binding Buffer加入酶切樣、PCR產物或者切下來的凝膠條中充分混勻,加入柱中離心,洗滌,用10微升ddH2O或Elution Buffer洗脫即可。純化的產物可用于連接、標記、測序、雜交、酶切、顯微注射、體外轉錄等后繼實驗。由于洗脫體積小,無需進一步濃縮也能保證很高的回收率。比如雙酶切,可以在第一次酶切后將酶切樣直接純化,留下1、2微升電泳檢測,剩下的7、8微升樣品全部進行下一個酶切,非常方便,不會浪費樣品。不過它的吸附范圍是70bp到4kb,而不是以往的10kb。4kb以上的只能用以前的Qiaquick系列了,而10kb以上就該用QIAEX II系列。和以往一樣,MinElute系列也分為PCR回收試劑盒、膠回收試劑盒、反應產物回收試劑盒可供選擇。
記得一位回國訪問的老師曾經說起,以前覺得美國學生笨,只會照著試劑盒123的作實驗,沒了說明書就不知如何是好,而中國學生聰明,能夠靈活運用,可是如今發現中國學生有時太過靈活,省略不作對照、自作聰明地簡化實驗步驟,最后出了問題也找不到原因,反而不好。當時我們就說,沒辦法,都是沒錢惹的禍,舍不得買試劑盒——能省就盡量將就一下,就是買了還要想辦法節約一個對照,有時候就這么養成這種小家子氣的習慣。回過頭來想,真是:所謂“Research”就是要反反復復的“search”,不斷失敗,不斷“search”,如果一下子就成功就不叫“Research”了,沒有嚴謹良好的實驗習慣就很難找到失敗的原因,就很難做好Research。