原位雜交定位(in situ hybridization) 這是分子水平和染色體水平相結合的基因定位方法。將待定位基因的特定DNA序列或該基因轉錄產生的RNA分子作為探針，在標記了放射性同位素或非放射性化學物質后與變性后的染色體DNA雜交，該探針就會同染色體DNA中與其互補的序列結合成為雙鏈，通過放射自顯影或顯色技術，就可將標記了放射性同位素或非放射性化學物質的探針在染色體上的位置，達到基因定位的目的。
原位雜交基因定位的精度取決于兩個因素。一是染色體顯帶分辨的精細程度。如果染色體是一般的常規染色，則定位只能區分出位于染色體的長臂或短臂，靠近著絲粒或端粒。如果染色體作分帶顯色，基因就可定位在染色體的某一區帶上。染色體顯帶越精細，則定位也可相應地提高其精度。
另一個因素是探針標記的靈敏度。當用放射性同位素磷(32P)標記探針，雜交后作放射自顯影后得到的雜交信號往往很強，會覆蓋染色體上很大的區段，不易確定與探針同源的序列所在的精確位置。改用放射性同位素硫(35S)后，情況稍有改善。用非放射性化學物質如熒光素標記探針后，則在熒光顯微鏡下，探針所在的位置上可呈現出熒光，這稱為熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)。當采用可呈現不同顏色的熒光素標記不同基因的探針后，可在同一個中期染色體標本上同時定位幾個基因。這種技術同樣可用于檢測染色體的易位畸變。例如，用某條染色體所特有的重復序列作為探針，當該條染色體的一個片段易位到另一條染色體上時，易位的那個片段將同熒光標記的探針結合而呈現出一片熒光，很易識別。同樣，不同的探針標記了不同顏色的熒光素后，染色體將被染成色彩斑斕的圖像。這稱為染色體涂染(chromosome painting)。