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mRNA差別顯示技術(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06
mRNA差別顯示技術(shù)也稱為差示反轉(zhuǎn)錄PCR(Differential Display of reverse Transcriptional PCR)簡稱為ddRT-PCR。它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于分離鑒定組織特異性表達(dá)的基因。差別基因表達(dá)(differential gene express)是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)。mRNA差別顯示技術(shù)正是對組織特異性表達(dá)的基因進(jìn)行分離的一種快速而行之有效的方法。該方法的基本原理是首先選取不同的組織樣品或不同發(fā)育階段的同一組織樣品或同一組織樣品經(jīng)不同藥物處理誘導(dǎo)的樣品,經(jīng)總RNA提取后,進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。此cDNA的合成是采用Oligo(dT)12 MN為引物,其中M為A,C,G中的任意一種,N為A,C,G或T中的任意一種,所以共有12種oligo(dT)12 MN引物,其中M稱為錨定堿基,起增大引物Tm值的作用,N稱為分類堿基,對反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分類。用這12種引物分別對同一總RNA樣品進(jìn)行cDNA合成,即進(jìn)行12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),從而使反轉(zhuǎn)錄的cDNA具有12種類型,也就是對cDNA進(jìn)行12種歸類(目前較為流行的方法是進(jìn)行4種歸類,即M為簡并堿基的形式存在),在此基礎(chǔ)上對每一類cDNA進(jìn)行隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄引物PCR擴(kuò)增,通過對組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析,從而反映出不同樣品間基因的時間和空間上組織特異性的表達(dá)。如此眾多種類的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PCR選擇擴(kuò)增后其類型依然為數(shù)眾多,很難用電泳系統(tǒng)加以快速準(zhǔn)確地分離。因而需要對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行歸類處理,減輕不同PCR產(chǎn)物電泳分離的難度,提高分離的準(zhǔn)確率。
 
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