一）基因組DNA分離、純化和加工

[Mbo I酶檢測]

1．準備1.5ml小試管4個；每管內含有：

基因組DNA（在TE或水中） 10.0μg

10×Mbo I緩沖液 2.5μl

H2O 12.0μl

2．向每管中分別加入：0.1，0.5，1或2單位的Mbo I酶。

3．37℃保溫到5，10，20，40分鐘后，分別從每管中移出6μl，在干冰中貯存到下一步時一并使用。

4．把16個樣品在瓊脂糖凝膠中進行電泳，并與標準分子量進行比較。

5．選擇參數為：能產生平均大小約20kb的時間和Mbo I的濃度。

[Mbo I酶切]

1．根據上述酶切檢測結果，選用最佳酶切條件，并把酶的量加大100倍，用以消化1mg的基因組DNA；取1個10~15ml的塑料管，加入：

含1mg基因組DNA 1.0ml

Mbo I 按所測定的量加

10×Mbo I緩沖液 250.0μl

H2O 1.2ml

按前述（5）中所測定出的時間（產生20kb）于37℃保溫。

2．用2.5ml 1：1酚和氯仿混合物抽提DNA.

3．把上層水相移入一新管中，加275μl 5M的NaCl。

4．加7ml乙醇，置冰水浴中沉淀10分鐘。

5．4℃，12 000g離心10分鐘。

6．倒除乙醇，重懸DNA于500μl TE緩沖液中，重懸過程在4℃中需數小時。

7．為獲得大小合適的DNA片段，將步驟6中的DNA分作6分（每分約80μl），分別放在含蔗糖梯度密度Beckman Ultra-clear SW41超離心管中，各通過蔗糖梯度密度儀。在含10~40%的蔗糖，20 mM Tris（pH7.4），10mM EDTA，1M NaCl等濃度中形成線性梯度。

8．135 000g 20℃離心16小時。

次日

9．用粗針頭在每一管的底部刺一小孔（依次收集6管中的DNA）每管按12滴（350~500μl）作為一分收集入a, b, c…數管中，然后再收集第二管、第三管等依次并入a, b, c各管中。

10． 從每分中都取10μl樣品加10μl水稀釋、4μl載樣緩沖液、用0.4%瓊脂糖凝膠電泳，然后與Hind Ⅲ酶切的λDNA標準分子量作比較，以確定那一分中所含片段為10~20kb大小。

11． 將含有16~20kb片段的管子并在一起，加2.5倍體積的乙醇，-20℃冷凍數小時。

第三天

12．10 000g 4℃離心10分鐘，收集DNA。

13．棄上清液，重懸于160μl TE緩沖液中。

14．對大小合適的片段（16~20kb）再按8~13重復梯度分離，但此次只用兩個管子即可；每管中各用80μl DNA。第二次蔗糖梯度分離后，將沉淀的DNA懸浮在50μl TE緩沖液中。

第四天

15．取2.5μl樣品（用溴化乙錠染色），與已知濃度和片段大小的DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳后，比較兩者染色強度，估算出DNA濃度，并確證所制備出插入片段的不同大小。

16．把樣品DNA濃度調到0.25μl/ml，-20℃貯存備用。

二）用于基因克隆載體DNA（噬菌體DNA）的制備

1. 用BamH I酶切EMBL3 DNA，加：

EBML3 DNA(500μg) 500μl

10×BamH I緩沖液 100μl

BamH I (10U/μl) 100μl

H2O 300μl

2. 于37℃保溫2小時。

3. 每管中加1體積（500μl）SS-酚和氯仿（1：1）混合物。充分混勻，于微型離心機中離心2分鐘以分離兩相，吸取上清水相至新管。

4. 在每管中加500μl氯仿，充分混勻，離心2分鐘，分相。

5. 吸水相轉入新管。

6. 在各試管中加50μl 5M NaCl，再加1ml乙醇。冰水浴中冷卻10分鐘。

7. 在微型離心機中4℃離心5分鐘。

8. 棄去上清液，加1ml 80%乙醇洗滌沉淀物，離心棄去液體。

9. DNA沉淀物真空干燥。

10. 用500μl TE緩沖液溶解沉淀物。

11. EcoR I酶切EBML3 DNA，加：

從步驟10中所獲DNA 500μl

10×EcoR I緩沖液 100μl

EcoR I (1 000U) 100μl

H2O 300μl

12. 于37℃保溫4小時。

13. 按3-9抽提、沉淀并回收。

14. 用500μl TE緩沖液溶解沉淀物。

15. 異丙醇沉淀：在步驟14中得到的500μl DNA于1.5ml離心管中加：3M 醋酸鈉（pH6.0）75μl，異丙醇（在1.5ml微型離心管中）300μl。

16. 冰水浴中置15分鐘。

17. 在微型離心機中4℃離心10分鐘。

18. 棄上清液，用200μl 0.35M醋酸鈉和乙醇（1：2.5）溶液洗滌沉淀物。

19. 在微型離心機中4℃離心10分鐘。

20. 重復步驟18和19。

21. 棄去上清液，真空干燥沉淀物。

22. 以0.5μg/μl濃度溶解于TE緩沖液中。

23. -20℃保存備用。

三）基因組DNA和載體噬菌體DNA的連接和包裝

1．可按下列步驟在5個1.5ml的小離心管中（用筆標記上從A到E）加入下列試劑：10×連接酶緩沖液1.0μl，載體臂DNA（0.5μg/μl）2.0μl。

2．再往每管中加：

 A
 B
 C
 D
 E
 
Mbo I插入片段（0.25μg/μl）
 -
 1μl
 2μl
 3μl
 4μl
 
H2O
 6μl
 5μl
 4μl
 3μl
 2μl
 
T4 DNA連接酶
 1μl
 1μl
 1μl
 1μl
 1μl
 
每管總量10μl
 
 
 
 
 
 

3. 令其充分混合，離心，于14℃保溫12~16小時，連接物可在-20℃下保存備用。

4. 包裝方法：為簡便起見，可購買包裝抽提物。各管子中的10μl連接液都用于包裝，按產品說明書進行操作。包括將連接物和包裝抽提液混合，然后22℃保溫2小時。

5. 包裝混合液用TMG緩沖液稀釋至250μl，包裝后的DNA于4℃保存，切勿冷凍。

6. 取等分稀釋液，倒平板，確定建庫的最適比例；然后按最適比例一系列連接和包裝反應，再合并。構建文庫要測效價和倒平板，以便供篩選和擴增之用。

四） 測效價和制備文庫平板

1．取500ml消毒培養瓶，注入100ml消毒LB培養液，再接種入2ml含有新鮮LE392細菌的麥芽糖液，培養至OD600近1.0。

2．收集細胞分別于兩個帶螺旋帽50ml聚苯乙烯管中；2500g離心10分鐘。

3．棄上清，把每一沉淀物重懸入25ml消毒的10mM MgSO4中。

4．LE392細胞在4℃中可存兩周；貯存過長會降低接種存活率。

5．接種噬菌體和測效價：從每250μl包裝反應液中取1μl（從前（三）中5），加入到99μl TMG中，分1μl和10μl此稀釋液加入13mm（直徑）×100mm（長）消毒管中；同時也稀釋和鋪制克隆載體平板、連接和包裝，但無插入（三種A管），作為本底對照。

6．從4步驟向每管中加200μl LE392細菌，混勻，室溫孵育20分鐘。

7．加2.5ml含有10 mM MgSO4的上層瓊脂（48℃）；在室溫中把每管立即倒入瓊脂平板上，旋動，令上層瓊質分散均勻。

8．室溫中置5分鐘，令瓊脂變硬，反置平板，37℃中培養8~16小時，當LE392細胞長滿后，由于溶菌作用，空斑形成將非常明顯。

9．計算每一包裝反應效價，統計每一平板空斑數，理想濃度的插入片段的效價應是：如建立文庫成功，與無插入對照文庫相比，至少大5~10倍。

10． 放大：如需放大，應用足夠反應樣品去建庫，在最適條件下重復連接和包裝反應，但不擴大反應規模；對哺乳動物基因組，理想的目標文庫大小是1~2×106噬菌斑，合并包裝混合物，并通過倒平板計算噬菌斑數，用來測定其效價，或文庫的含量。

11． 以下7個步驟是倒平板供文庫篩選，如果篩選前要擴增文庫，則可按六、文庫擴增法進行，然后再回到步驟12。

12． 文庫倒平板篩選：要篩選5×105~106噬菌斑，一般每個90mm LB瓊脂平板上有104噬菌體；先取20ml LE392細胞；裝入50ml無菌帶帽塑料試管中，在細菌中加入已知效價的包裝混合液5×105~106噬菌斑，混合。

13． 室溫中置20分鐘，令噬菌體附到細胞上。

14． 在50~100個13×100mm的無菌玻璃試管中各加200μl受吸附的細菌。

15． 室溫下每管各加2.5ml 48℃融化的無菌LB上層瓊脂糖，并立即倒在LB瓊脂平板上，搖動使之分布均勻，連續倒完全部平板。

16． 室溫下置15分鐘，使上層瓊脂糖凝固，于37℃倒置培養8~16小時。

17． 此間將出現噬菌斑。

18． 4℃保存平板。

五） 用放射性探針篩選已倒平板的文庫

1. 將瓊脂平板翻轉，令瓊脂面下，去掉培養皿蓋，在室溫中空氣干燥30分鐘。

1．給每個培養皿編號，用筆在對應的NC濾膜上編號。

2．把濾膜小心地鋪在瓊脂平板上，編號朝上，濾膜0.5~1分鐘內變濕，持續20分鐘使噬菌斑吸附到NC濾膜上。

3．用一根干凈的18號針頭穿過濾膜和瓊脂糖，戳5~10個孔，使濾膜在瓊脂糖膜上定位（此步很重要）。

4．用扁鉗小心緩慢從平板上揭下濾膜，注意不要掀起含噬菌體的瓊脂糖層，用記號筆在培養皿底部標記針孔。

5．令號碼面朝下，在室溫中置30分鐘讓濾膜干燥，每個平板可再影印第2張濾膜，此對消除假陽性信號很有用，因所有的真陽性應在兩張膜的同一位置上雜交，另外，第二張濾膜也可用第二種探針雜交。

6．將濾膜相繼浸入100ml下列3種溶液中（30~60秒/每次）：

a. 0.2M NaOH，1.5M NaCl

b. 2×SSC，0.4M Tris pH7.4

c. 2×SSC

每浸潤25張濾膜后更換一次溶液

7．硝酸纖維素膜面朝上，放置在Whatman 3mm紙上，室溫種干燥1小時。

8．80℃真空干燥2小時。

9． 用雜交緩沖液濕潤所有濾膜，切口平移的探針用緩沖液-N，合成探針用緩沖液-S。

10． 在1只1L燒杯中，放入濾膜和足夠量的雜交緩沖液，浸泡濾膜。

11． 準備雜交探針：將比活性為108cmp/μg的切口平移探針0.25μg加到1個帶螺紋帽的50ml試管中，加0.5ml 2mg/ml的鮭魚精子DNA溶液，再依次加入下列溶液并振蕩混合使其變形：10M NaOH 50μl; 2M Tris pH7.4 300μl; 1M HCl（延壁加）500μl。

12． 將此變性的探針加到放有濾膜和緩沖液的燒杯中，旋轉均勻。

13． 于42℃振蕩（輕輕搖動）4~16小時，使切口平移探針雜交（合成探針的保溫溫度不同）。

14． 倒出燒杯中的雜交緩沖液，用500ml含0.1%SDS(W/V)2×SSC溶液在室溫中搖動15分鐘。

15． 按步驟15再洗兩次，低鹽洗滌前用吸水紙吸干所有濾膜。

16． 用含0.1%SDS(W/V)0.1×SSC 500ml，52℃洗滌濾膜兩次，每次15分鐘。

17． 倒去洗滌緩沖液，用Whatman 3mm濾紙吸干濾膜，在空氣中干燥1小時。

18． 將NC濾膜貼在3mm濾紙上，用放射性墨水標記3mm濾值；濾膜用干凈塑料紙包好，用增強屏在XAR-5底片下于-70℃曝光過夜，檢測陽性信號。

第二次篩選

19． 將200μl LE392指示菌加到13×100mm試管中。加2.5ml含10mM MgSO4的48℃ LB上層瓊脂，室溫下立即倒入90mm的LB瓊脂板上，靜止5分鐘使之凝固，形成細菌苔，在培養皿底劃50個格子，供第二次噬菌體的生長。

20． 按照膜上放射性墨水標記與X光底片對齊，用標記筆將膜上的位置孔標記在底片上，用透射光幫助對齊。

21． 根據放射自顯影信號，用牙簽挑取陽性噬菌體斑或其附近噬菌體。

22． 將牙簽上噬菌體斑，點在各個菌苔方格里，只要將牙簽尖在菌苔上輕輕觸一下即可。

23． 倒置平板，37℃培養過夜。

24． 加蓋NC濾膜，篩選，按步驟1-19進行。

第三次篩選

25． 用牙簽轉移來自每一個原始陽性信號的第二輪單個雜交噬菌斑中的噬菌體，每個牙簽可轉移106~107個噬菌體顆粒。

26． 將牙簽放進盛有10ml無菌TMG緩沖液的無菌管中，劇烈振蕩混合，以混勻噬菌體。

27． 將步驟27的TMG混合液0.25μl和2.5μl放入兩個含有200μl LE 392倒平板細胞的13×100mm管子內，加2.5ml 48℃含10mM MgSO4的LB上層瓊脂，室溫下立即倒在90mm的LB瓊脂板上，搖動使之分布均勻，室溫下凝固15分鐘。

28． 倒置平板，37℃培養過夜，每個平板應形成50~500個噬菌斑。

29． 用干凈牙簽從100~200個單獨分開的噬菌斑中，把噬菌體轉移到長有LE392菌苔的平板上。

30． 倒置平板，37℃培養過夜。

31． 按步驟1-19對格子里的噬菌體作第三次雜交和篩選。陽性信號為純化的噬菌斑克隆，每一個來自初始陽性信號的“戰勝者”，按步驟26用牙簽轉移到5ml TMG液。

32． 加1μl TMG混合液到200μl LE392到平板細胞中，按步驟28和29進行，37℃倒置培養過夜。

33． 此平板上所有的噬菌斑，都是該克隆的純化噬菌斑，這平板可用Parafilm封柱，貯于4℃中，作為克隆的原種。平板上的單個噬菌斑，可直接用于這種噬菌體生長的制備。

六）文庫擴增

1．每2×104文庫中的噬菌體在一個無菌的13×100mm試管中同200μl LE392細胞混合。一般說，擴增2×106個噬菌斑的文庫需100個試管，室溫下吸附培養20分鐘。

2．在每個試管中加入含10mM MgSO4 48℃的軟瓊脂2.5ml室溫下立即倒在90mm的LB瓊脂板上，搖動鋪勻，不要倒轉平板，否則瓊脂會滑到一邊，37℃培養6~10小時。

3．當噬菌體開始形成針尖狀噬菌體斑，而尚未變大連接成片時，加2ml LB培養液，用無菌塑料棒或彎曲的移液玻璃管從平板上刮下軟瓊脂，裝入一個無菌的1L燒杯中，每100ml體積平板上刮下的軟瓊脂中加2ml氯仿。

4．在一末端為圓錐形的無菌離心管中，3000g離心混合物10分鐘，瓊脂和細菌碎片將在管底形成沉淀，輕輕倒出含有擴增文庫的上清液。

5．測定文庫體積：加NaCl晶體至種濃度為1M。

6．稀釋和倒平板，以測定擴增文庫效價，標準的效價為每1ml 5×109~1010個噬菌體。

7．將文庫分裝在1ml無菌管中，每管加3滴氯仿，4℃貯存。

8．在倒平板和篩選前再測定文庫效價。