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用T4噬菌體多核苷酸激酶標記寡核苷酸探針

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-04-26

 

  合成的寡核苷酸在合成時其5'端缺少一個磷酸基, 因而極易用T4噬菌體多核苷酸化反應,這種探針可達到于γ=32P從[γ=32P]ATP本身同樣高的放射比活度。下面所述的反應是為對10pmol寡核苷酸進行高比活度的標記而設計的。通過擴大或縮小這一反應的規模便可成功地標記不同量的寡核苷酸,而各成分的濃度則可保持不變。
1)配制下列反應混合液:
寡核苷酸(10pmol/μl) 1.0μl
10xT4噬菌體多核苷酸酶緩沖液 2.0μl
[γ=32P]ATP(比活度5000Ci/mmol;10mCi/ml水溶液)(10pmol) 5.0μl水 11.4μl
10xT4噬菌體多核苷酸激酶緩沖液
0.5mol/L Tris.Cl(pH7.6)
0.1mol/L MgCl2
50mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)
1mol/L 鹽酸亞清胺
1mol/L EDTA(pH8.0)充分混勻,在一裝有10μl 10mol/L Tris.Cl(pH8.0)的反應管內加入0.5μl上述反應混合液,擱置一旁留備步驟3)中使用。該反應所含[γ=32P]ATP和寡核苷酸的濃度相等,僅有50%的放射性標記物被轉移至寡核苷酸。若將反應中寡苷酸濃度增至原來的10倍,可提高轉移的效率,其結果導致近90%的放射性標記物轉移至寡核苷酸。但是,寡核苷酸的放射性比活度卻會降至原來的1/5。如果對一段寡酸進行高比活度標記,可以:
a.將反應中[γ=32P]ATP的濃度增加至原來的3倍(即反應混合液中使用15μl放射性標記物而水的體積減小至1.4μl。
b.將寡核苷酸濃度減小至3pmol。在這些情況下,僅有約10%的放射性標記物被轉移,但實際上每個寡核苷酸分子都被標記。
2)在反應混合液中加入8單位(約1μl)T4噬菌體多核苷酸激酶。 充分混勻,于37℃溫育45分鐘。人該反應液中另取0.5 μl 加至另一裝有10 10mmol/LTris.Cl(pH8.0)的反應管中,擱置一旁留備步驟3)使用。于68℃將其余的反應液加熱10分鐘,以滅活T4噬菌體多核苷酸激酶。
3)按下列方法(Stawinski等,1977;Narang等,1980)確定32 P轉移至寡核苷酸的效率并估算其比活度:
a.切下一張長約15cm、寬約5cm的浸過聚乙烯亞胺(Polygram CEL 300EI:Brinkmann)的纖維素紙條。用一支軟鉛鉛筆在距一端2.5cm 處劃一條橫過紙條的細直線,在直線上作兩個記號,兩個記號間相距約1in(2.54cm)。
b.在兩個記號處分別點上步驟1)、2)中擱置一旁的液體各0.5μl,將紙條垂直置于一層析皿內,以使放射性樣品處于紙條的下緣。紙條的底部應伸入一盛有高度的約為0.5cm的展開緩沖液(0.5mol/L碳酸氫銨)的平皿內。蓋上層析擄。 使層析展開直至溶劑前沿遷移約4-5in(10.16-12.7cm)。
c.將聚乙烯亞胺-纖維素紙條包裹于Saran包裝膜內,進行放射自顯影,或將紙條水平切成窄(0.25cm)條,在液體閃爍計數儀中測量每一窄條的放射性活度。寡核苷酸仍留在起點處,而ATP和無機磷酸將與溶劑作同量方向移動,無機磷酸較溶劑前沿遷移得稍慢些,而ATP的位置幾乎與起點和無機磷酸等距離。這樣,如有磷酸從γ-32P]ATP轉移至寡核苷酸,將導致原點樣處出現放射性。 通過測量起點處和整張紙條的放射性活度值,便可計算出從γ-32P] ATP轉移至寡核苷酸的放射性標記物所占百分比。再根據反應中胡核苷酸和γ-32P] ATP的摩爾數,便可計算出探針的比活度。在上述反應條件下,應有近50%的放射性活度轉稱至寡核苷酸,結果比活度接近2500Ci/mmol。轉移至寡核苷酸的放射性標記亦可通過用DE-81濾膜吸收法來測定。寡核苷酸與帶正電荷的濾膜牢固結合,而未摻入的放射性標記物則可用磷酸鈉溶液反復洗滌而去除。
4)如果探針的比活度符合要求,則繼續進行放射性標記的合成寡核苷棧的純化。如果比活度太低,則另補加8單位酶, 繼續于37 ℃進一步溫育30分鐘(即共75分鐘),并于68℃加熱10分鐘使酶失活,再次分析該反應的產物。

 

 
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