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原理
分光光度法是指應(yīng)用分光光度計的分析方法，因其具有靈敏、準(zhǔn)確、快速及選擇性好等特點被廣泛應(yīng)用于實驗室的元素分析，分光光度計的使用雖然簡單，但是其原理及一些基礎(chǔ)知識想必有許多小伙伴也是不了解的，分享給大家，希望能對你有所幫助。
1、物質(zhì)對光的選擇性吸收
當(dāng)光束照射到物質(zhì)上時，光與物質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生反射、散射、吸收或透射。若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。 （1）溶液顏色的產(chǎn)生
當(dāng)一束白光通過某一有色溶液時，一些波長的光被溶液吸收，另一些波長的光則透過溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。人把自身能感覺到的光定義為可見光。在可見光區(qū)，不同波長的光呈現(xiàn)不同的顏色，因此溶液的顏色由透射光的波長所決定。透射光與吸收光可組成白光，故稱這兩種光互為補色光，兩種顏色互為補色。
（2）光吸收的本質(zhì)
當(dāng)一束光照射到某物質(zhì)或其溶液時，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量就轉(zhuǎn)移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態(tài)（基態(tài)）躍遷到較高能態(tài)（激發(fā)態(tài)），這個作用稱為物質(zhì)對光的吸收。
被激發(fā)的粒子約在10-8s后回到基態(tài)，并以熱或熒光等形式釋放出能量。分子、原子或離子具有不連續(xù)的量子化能級，僅當(dāng)照射光光子的能量hυ，與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當(dāng)時，才能發(fā)生吸收。不同物質(zhì)微粒由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的量子化能級，其基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差也不相同。所以物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。
（3） 吸收曲線
吸收曲線，也稱為吸收光譜，描述了物質(zhì)對不同波長的光的吸收能力。將不同波長的光透過某一固定濃度和厚度的有色溶液，測量每一波長下有色溶液對光的吸收程度（即吸光度），然后以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制的曲線即為吸收曲線。
不同濃度的同一物質(zhì)，在吸收峰附近的吸光度隨著濃度增加而增大，但最大吸收波長不變。若在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度最高。因此，吸收曲線是分光光度法中選擇測定波長的重要依據(jù)。
2、光吸收基本定律
即朗伯-比爾定律：
當(dāng)一束平行單色光通過液層厚度為b的有色溶液時，溶質(zhì)吸收了光能，光的強度就要減弱。溶液的濃度越大，通過的液層厚度越大，入射光越強，則光被吸收的越多，光強度的減弱也越顯著。該定律是紫外可見分光光度法等各類吸光光度法定量分析的依據(jù)，是由實驗觀察得到的，不僅適用于溶液，也適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度；
I0-入射光強度，cd；
I-透射光強度，cd；
ε-吸光系數(shù)，L/(mol˙cm)；
b-液層厚度（光程長度），cm；
c-有色溶液的濃度，mol/L。
其物理意義為：當(dāng)一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
式中ε是吸光物質(zhì)在特定波長和溶劑的情況下的一個特征常數(shù)，數(shù)值上等于濃度為1mol/L的吸光物質(zhì)在1cm光程中的吸光度。ε是吸光物質(zhì)吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。由實驗結(jié)果計算ε時，常以被測物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，實際上時表觀摩爾吸光系數(shù)。在多組分體系中，如果各種吸光物質(zhì)之間沒有相互作用，體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。
透光度T是透射光強度I與入射光強度I0之比，即：
T=I/I0
因此：A=lg(1/T)
盡管光度計種類型號繁多，但它們都是由相同的基本部件組成的，包括光源、單色器、吸收池和檢測系統(tǒng)。
1、光源
在測量吸光度時，要求光源發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，要具有足夠的光強度，并在一定時間內(nèi)能保持穩(wěn)定。
在可見光區(qū)測量時，通常使用鎢絲燈作為光源。鎢絲加熱到白熾狀態(tài)時會發(fā)出波長在320~2500nm之間的連續(xù)光譜。鎢絲燈工作溫度一般為2600~2870K，熔點為3680K。鎢絲燈的溫度決定于電源電壓，電源電壓的微小波動會引起鎢燈光強度的很大變化，因此必須使用穩(wěn)壓電源。
在紫外區(qū)測量時，常采用氫燈或氘燈產(chǎn)生波長在180~375nm之間的連續(xù)光譜作為光源。其理想光源應(yīng)具有覆蓋整個紫外可見光區(qū)的連續(xù)輻射，強度應(yīng)比較高，且隨波長變化能量變化不大，但在實際上難以實現(xiàn)。氘燈輻射強度比氫燈高2~3倍，壽命也比較長。氙燈的強度一般高于氫燈，但欠穩(wěn)定，波長范圍180~1000nm，常用作熒光分光光度計的激發(fā)光源。
2、單色器
單色器是將光源發(fā)射的復(fù)合光分解為單色光的裝置。
一般由5部分組成：入光狹縫、準(zhǔn)光氣（一般由透鏡或凹面反光鏡使入射光成為平行光束）、色散器、投影器（一般由一個透鏡或凹面鏡將分光后的單色光投影至出光狹縫）、出光狹縫。
色散器是單色器的核心部分，常用的色散元件是棱鏡或光柵。
棱鏡由玻璃或石英制成，玻璃棱鏡色散能力強，但吸收紫外光，只能用于350-820nm波長的分析測定，在紫外區(qū)必須用石英棱鏡。
光柵的特點是：色散均勻，呈線性，光度測量便于自動化，工作波段廣。
3、吸收池
也稱為比色皿，是盛放樣品溶液的容器，具有兩個互相平行、透光且具有精確厚度的平面。
玻璃吸收池光程長度一般為1cm，也有0.1-10cm的。
由于吸收池厚度存在一定誤差，其材質(zhì)對光不是完全透明，在做定量分析時，對吸收池應(yīng)做配套性試驗，試驗后標(biāo)記出放置方向。
紫外光區(qū)數(shù)值不跳為石英。
4、檢測系統(tǒng)
檢測系統(tǒng)包括檢測器和記錄顯示裝置。
檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，將光強度轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栵@示出來。
常用的檢測器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測器等。
光電池的光電流較大，不用放大，用于初級的分光光度計上，疲勞效應(yīng)嚴(yán)重。
光電倍增管利用二次電子發(fā)射來放大光電流，放大倍數(shù)可高達(dá)108倍，應(yīng)用最為廣泛。
光二極管陣列檢測器由于全部波長同時被檢測，掃描速度快，可在0.1s內(nèi)完成對190-800nm波長范圍的掃描。
記錄顯示裝置包括放大器和結(jié)果顯示裝置。70年代采用數(shù)字讀出裝置。現(xiàn)代在主機中裝備有微處理機或外接微型計算機，控制儀器操作和處理測量數(shù)據(jù)，裝有屏幕顯示、打印機和繪圖儀等。
1、顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇
進(jìn)行比色分析或光度分析時，首先要把待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物，然后進(jìn)行比色或光度測定。
將待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫顯色反應(yīng)，與待測組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。 （1）顯色反應(yīng)的選擇
顯色反應(yīng)分兩類，即絡(luò)合反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，絡(luò)合反應(yīng)是最主要的顯色反應(yīng)。
選用的原則是：
選擇靈敏的顯色反應(yīng)。摩爾吸光系數(shù)ε的大小是顯色反應(yīng)靈敏度高低的重要標(biāo)志，因此應(yīng)當(dāng)選擇生成的有色物質(zhì)的ε較大的顯色反應(yīng)。一般來說，當(dāng)ε為104-105時，可認(rèn)為該反應(yīng)靈敏度較高。
盡可能選擇選擇性好的顯色劑。即顯色劑僅與一個組分或少數(shù)幾個組分發(fā)生顯色反應(yīng)。
顯色劑在測定波長處無明顯吸收。通常把兩種有色物質(zhì)最大吸收波長之差稱為對比度，一般要求顯色劑與有色化合物的對比度在60nm以上。
反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。
（2）顯色條件的選擇
吸光光度法測定的是顯色反應(yīng)達(dá)到平衡后溶液的吸光度，因此要得到準(zhǔn)確的結(jié)果，必須從研究平衡著手，了解影響顯色反應(yīng)的因素，控制適當(dāng)?shù)臈l件，使顯色反應(yīng)完全和穩(wěn)定。
根據(jù)溶液平衡原理，有色絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)越大，顯色劑過量越多，越有利于待測組分形成有色絡(luò)合物。但是過量顯色劑的加入有時會引起副反應(yīng)，對測定反而不利。
酸度對顯色反應(yīng)的影響是多方面的。一種金屬離子與某種顯色劑反應(yīng)的適宜酸度范圍是通過實驗來確定的。確定的方法是固定待測組分及顯色劑的濃度，改變?nèi)芤簆H值，測定其吸光度，作出吸光度-pH值關(guān)系曲線，選擇曲線平坦部分對應(yīng)的pH值作為測定條件。
顯色反應(yīng)一般在室溫下進(jìn)行，有的反應(yīng)需要加熱，以加速顯色反應(yīng)，使之進(jìn)行完全。
大多數(shù)顯色反應(yīng)需要經(jīng)過一定的時間才能完成，其長短與溫度的高低有關(guān)，也會受到空氣的氧化或發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)使眼色顏色減弱。因此必須通過實驗作出在一定溫度下的吸光度-時間關(guān)系曲線，得到適宜的顯色時間。
1、干擾的類型
光度分析中，共存離子如本身有顏色，或與顯色劑作用生成有色化合物，都將干擾測定。
a.干擾離子本身有顏色
b.干擾離子本身無顏色，但能與顯色劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的配合物。若生成的配合物有色則直接干擾測定，若生成的配合物無色，也降低了顯色劑的濃度，影響被測離子與顯色劑的反應(yīng)，而產(chǎn)生誤差。
c.干擾離子與被測離子反應(yīng)生成配合物或沉淀，影響被測離子的測定。
2、消除干擾的方法
a.控制溶液酸度。
b.加入掩蔽劑與干擾離子形成更穩(wěn)定的化合物，使干擾離子不再產(chǎn)生干擾。
c.里用參比溶液消除某些有色干擾離子的影響。
d.選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ鞑ㄩL以消除干擾。
e.采用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法。
1、入射光波長的選擇
應(yīng)根據(jù)吸收光譜曲線，選擇溶液具有最大吸收時的波長作為入射光的波長。如顯色劑與鈷絡(luò)合物在420nm波長處均有最大吸收峰。如用此波長測定鈷，則未反應(yīng)的顯色劑會造成干擾而降低測定的準(zhǔn)確度。因此必須選擇在500nm波長處測定，在此波長下顯色劑不發(fā)生吸收。而鈷絡(luò)合物則有一吸收平臺。
2、參比溶液的選擇
（1）如果僅待測物與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，可用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤骸?br /> （2）如果顯色劑或其他試劑略有吸收，應(yīng)用空白溶液（不加試樣的溶液）作參比溶液。
（3）如試樣中其他組分有吸收，但不與顯色劑反應(yīng)，則當(dāng)顯色劑無吸收時，可用試樣溶液作參比溶液，當(dāng)顯色劑略有吸收時，可在試液中加入適當(dāng)掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，以此溶液作參比溶液。
3、吸光度讀數(shù)范圍的選擇
實踐證明，吸光度在0.2-0.5內(nèi)時，測量的相對誤差最小。
可用兩種方法來調(diào)整被測溶液的吸光度：
（1）控制被測溶液的濃度。如改變?nèi)恿浚淖內(nèi)芤旱臐饪s倍數(shù)或稀釋倍數(shù)。
（2）選擇不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程長的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。
當(dāng)光束照射到物質(zhì)上時，光與物質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生反射、散射、吸收或透射。若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。
當(dāng)一束白光通過某一有色溶液時，一些波長的光被溶液吸收，另一些波長的光則透過溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。人把自身能感覺到的光定義為可見光。在可見光區(qū)，不同波長的光呈現(xiàn)不同的顏色，因此溶液的顏色由透射光的波長所決定。透射光與吸收光可組成白光，故稱這兩種光互為補色光，兩種顏色互為補色。
當(dāng)一束光照射到某物質(zhì)或其溶液時，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量就轉(zhuǎn)移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態(tài)（基態(tài)）躍遷到較高能態(tài)（激發(fā)態(tài)），這個作用稱為物質(zhì)對光的吸收。
被激發(fā)的粒子約在10-8s后回到基態(tài)，并以熱或熒光等形式釋放出能量。分子、原子或離子具有不連續(xù)的量子化能級，僅當(dāng)照射光光子的能量hυ，與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當(dāng)時，才能發(fā)生吸收。不同物質(zhì)微粒由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的量子化能級，其基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差也不相同。所以物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。
吸收曲線，也稱為吸收光譜，描述了物質(zhì)對不同波長的光的吸收能力。將不同波長的光透過某一固定濃度和厚度的有色溶液，測量每一波長下有色溶液對光的吸收程度（即吸光度），然后以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制的曲線即為吸收曲線。
不同濃度的同一物質(zhì)，在吸收峰附近的吸光度隨著濃度增加而增大，但最大吸收波長不變。若在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度最高。因此，吸收曲線是分光光度法中選擇測定波長的重要依據(jù)。
即朗伯-比爾定律：
當(dāng)一束平行單色光通過液層厚度為b的有色溶液時，溶質(zhì)吸收了光能，光的強度就要減弱。溶液的濃度越大，通過的液層厚度越大，入射光越強，則光被吸收的越多，光強度的減弱也越顯著。該定律是紫外可見分光光度法等各類吸光光度法定量分析的依據(jù)，是由實驗觀察得到的，不僅適用于溶液，也適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度；
I0-入射光強度，cd；
I-透射光強度，cd；
ε-吸光系數(shù)，L/(mol˙cm)；
b-液層厚度（光程長度），cm；
c-有色溶液的濃度，mol/L。
其物理意義為：當(dāng)一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
式中ε是吸光物質(zhì)在特定波長和溶劑的情況下的一個特征常數(shù)，數(shù)值上等于濃度為1mol/L的吸光物質(zhì)在1cm光程中的吸光度。ε是吸光物質(zhì)吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。由實驗結(jié)果計算ε時，常以被測物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，實際上時表觀摩爾吸光系數(shù)。
T=I/I0
因此：A=lg(1/T)
主要部件
在測量吸光度時，要求光源發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，要具有足夠的光強度，并在一定時間內(nèi)能保持穩(wěn)定。
在可見光區(qū)測量時，通常使用鎢絲燈作為光源。鎢絲加熱到白熾狀態(tài)時會發(fā)出波長在320~2500nm之間的連續(xù)光譜。鎢絲燈工作溫度一般為2600~2870K，熔點為3680K。鎢絲燈的溫度決定于電源電壓，電源電壓的微小波動會引起鎢燈光強度的很大變化，因此必須使用穩(wěn)壓電源。
在紫外區(qū)測量時，常采用氫燈或氘燈產(chǎn)生波長在180~375nm之間的連續(xù)光譜作為光源。其理想光源應(yīng)具有覆蓋整個紫外可見光區(qū)的連續(xù)輻射，強度應(yīng)比較高，且隨波長變化能量變化不大，但在實際上難以實現(xiàn)。氘燈輻射強度比氫燈高2~3倍，壽命也比較長。氙燈的強度一般高于氫燈，但欠穩(wěn)定，波長范圍180~1000nm，常用作熒光分光光度計的激發(fā)光源。
單色器是將光源發(fā)射的復(fù)合光分解為單色光的裝置。
一般由5部分組成：入光狹縫、準(zhǔn)光氣（一般由透鏡或凹面反光鏡使入射光成為平行光束）、色散器、投影器（一般由一個透鏡或凹面鏡將分光后的單色光投影至出光狹縫）、出光狹縫。
色散器是單色器的核心部分，常用的色散元件是棱鏡或光柵。
棱鏡由玻璃或石英制成，玻璃棱鏡色散能力強，但吸收紫外光，只能用于350-820nm波長的分析測定，在紫外區(qū)必須用石英棱鏡。
光柵的特點是：色散均勻，呈線性，光度測量便于自動化，工作波段廣。
也稱為比色皿，是盛放樣品溶液的容器，具有兩個互相平行、透光且具有精確厚度的平面。
玻璃吸收池光程長度一般為1cm，也有0.1-10cm的。
由于吸收池厚度存在一定誤差，其材質(zhì)對光不是完全透明，在做定量分析時，對吸收池應(yīng)做配套性試驗，試驗后標(biāo)記出放置方向。
紫外光區(qū)數(shù)值不跳為石英。
檢測系統(tǒng)包括檢測器和記錄顯示裝置。
檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，將光強度轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栵@示出來。
常用的檢測器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測器等。
光電池的光電流較大，不用放大，用于初級的分光光度計上，疲勞效應(yīng)嚴(yán)重。
光電倍增管利用二次電子發(fā)射來放大光電流，放大倍數(shù)可高達(dá)108倍，應(yīng)用最為廣泛。
光二極管陣列檢測器由于全部波長同時被檢測，掃描速度快，可在0.1s內(nèi)完成對190-800nm波長范圍的掃描。
記錄顯示裝置包括放大器和結(jié)果顯示裝置。70年代采用數(shù)字讀出裝置。現(xiàn)代在主機中裝備有微處理機或外接微型計算機，控制儀器操作和處理測量數(shù)據(jù)，裝有屏幕顯示、打印機和繪圖儀等。
測量條件的選擇
進(jìn)行比色分析或光度分析時，首先要把待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物，然后進(jìn)行比色或光度測定。
將待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫顯色反應(yīng)，與待測組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。
顯色反應(yīng)分兩類，即絡(luò)合反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，絡(luò)合反應(yīng)是最主要的顯色反應(yīng)。
選用的原則是：
選擇靈敏的顯色反應(yīng)。摩爾吸光系數(shù)ε的大小是顯色反應(yīng)靈敏度高低的重要標(biāo)志，因此應(yīng)當(dāng)選擇生成的有色物質(zhì)的ε較大的顯色反應(yīng)。一般來說，當(dāng)ε為104-105時，可認(rèn)為該反應(yīng)靈敏度較高。
盡可能選擇選擇性好的顯色劑。即顯色劑僅與一個組分或少數(shù)幾個組分發(fā)生顯色反應(yīng)。
吸光光度法測定的是顯色反應(yīng)達(dá)到平衡后溶液的吸光度，因此要得到準(zhǔn)確的結(jié)果，必須從研究平衡著手，了解影響顯色反應(yīng)的因素，控制適當(dāng)?shù)臈l件，使顯色反應(yīng)完全和穩(wěn)定。
根據(jù)溶液平衡原理，有色絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)越大，顯色劑過量越多，越有利于待測組分形成有色絡(luò)合物。但是過量顯色劑的加入有時會引起副反應(yīng)，對測定反而不利。
干擾的消除
光度分析中，共存離子如本身有顏色，或與顯色劑作用生成有色化合物，都將干擾測定。
a.干擾離子本身有顏色
b.干擾離子本身無顏色，但能與顯色劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的配合物。若生成的配合物有色則直接干擾測定，若生成的配合物無色，也降低了顯色劑的濃度，影響被測離子與顯色劑的反應(yīng)，而產(chǎn)生誤差。
c.干擾離子與被測離子反應(yīng)生成配合物或沉淀，影響被測離子的測定。
a.控制溶液酸度。
b.加入掩蔽劑與干擾離子形成更穩(wěn)定的化合物，使干擾離子不再產(chǎn)生干擾。
c.里用參比溶液消除某些有色干擾離子的影響。
d.選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ鞑ㄩL以消除干擾。
e.采用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法。
吸光度測量條件的選擇
應(yīng)根據(jù)吸收光譜曲線，選擇溶液具有最大吸收時的波長作為入射光的波長。如顯色劑與鈷絡(luò)合物在420nm波長處均有最大吸收峰。如用此波長測定鈷，則未反應(yīng)的顯色劑會造成干擾而降低測定的準(zhǔn)確度。因此必須選擇在500nm波長處測定，在此波長下顯色劑不發(fā)生吸收。而鈷絡(luò)合物則有一吸收平臺。
（1）如果僅待測物與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，可用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤骸?br /> （2）如果顯色劑或其他試劑略有吸收，應(yīng)用空白溶液（不加試樣的溶液）作參比溶液。
（3）如試樣中其他組分有吸收，但不與顯色劑反應(yīng)，則當(dāng)顯色劑無吸收時，可用試樣溶液作參比溶液，當(dāng)顯色劑略有吸收時，可在試液中加入適當(dāng)掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，以此溶液作參比溶液。
實踐證明，吸光度在0.2-0.5內(nèi)時，測量的相對誤差最小。
可用兩種方法來調(diào)整被測溶液的吸光度：
（1）控制被測溶液的濃度。如改變?nèi)恿浚淖內(nèi)芤旱臐饪s倍數(shù)或稀釋倍數(shù)。
（2）選擇不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程長的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。
