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蛋白質是構成生物體細胞組織的重要成分。食物中的蛋白質是人體中氮的唯一來源，具有不可替代的作用。含氮是蛋白質區別于其他有機化合物的重要標志。在檢驗食品中蛋白質時，通常是先檢定出食品中的總氮量，然后乘以蛋白質換算系數，以此得到蛋白質含量。凱氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作為標準檢驗方法。凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過程。
原理
樣品消化
蒸餾
吸收
滴定
注意事項
常見問題解答
向樣品中加入濃硫酸和催化劑，充分混勻，然后加熱消化分解，樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水，其中的有機氮轉化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。
濃硫酸具有脫水性和氧化性，可使有機物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水，蛋白質會分解為氨，然后氨與硫酸結合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來加快蛋白質分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點，一般情況下，純硫酸的沸點在340℃左右，但是在添加硫酸鉀后，可提高至400℃以上。提高溫度使有機物加快分解。但是不能加入過多的硫酸鉀，否則會因為溫度過高，使生成的硫酸銨發生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外，還可以指示消化終點的到達，有機物全部消化完全后，溶液呈現清澈的藍綠色，硫酸銅還可以做蒸餾時堿性反應的指示劑。
消化液中的硫酸銨在堿性環境下會轉化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出，影響測定結果，所以水蒸氣發生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強酸弱堿鹽，需要足夠的堿液使結合態的氨完全反應并釋放出來，這個過程中的氫氧化鈉一定要過量，過量的氫氧化鈉會與硫酸銅生成藍色的氫氧化銅沉淀，氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。檢驗蒸餾是否完成，可用奈氏試紙法，NH4+或NH3遇奈氏試劑會反應生成棕紅色的碘化汞銨化合物。
加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影響下一步滴定時指示劑的變色反應。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過40 ℃。
待吸收完全后，用硫酸或者鹽酸標準溶液進行酸堿滴定，滴定液的濃度直接影響結果的準確性，必須按照要求進行配制和標定。混合指示劑在中性溶液中呈灰色，滴定終點時液體呈灰色。
一、消化過程中容易沾壁怎么辦？消化后定氮瓶內有黑色殘留物怎么辦？
解答：稱樣時需要注意切勿使樣品粘附在定氮瓶頸部，避免因樣品未消化完全而造成結果偏低。消化過程中如果發生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色殘留物，可以在消化較完全時搖動定氮瓶，把定氮瓶肚上的黑色物質搖洗下來。搖動的方法是取下小漏斗，戴上防燙手套，手掌緊握瓶頸，向前后側甩，使瓶內液體呈半旋轉半振蕩狀態，注意控制力度不要讓液體濺離瓶口。
二、硫酸鉀的作用是催化劑嗎？
解答：硫酸鉀的作用是提高溶液沸點，從而加快有機物分解。
三、硫酸銅是否是消化終點以及加堿蒸餾時的指示劑？
解答：硫酸銅的作用有三個，分別為：
①催化作用：加速有機物的氧化分解。
②消化完全的指示劑：使液體呈現藍綠色澄清透明狀態。
③蒸餾時堿性反應的指示劑：產生褐色沉淀。
四、混合指示劑必須臨用時混合嗎？
解答：混合指示劑必須臨用時混合。
五、請問蒸餾的時取下錐形瓶，需要用洗瓶沖洗嗎？不沖洗會有誤差嗎？
解答：需要沖洗冷凝管下端以防止產生結果誤差。蒸餾后移動蒸餾液接收瓶,液面離開冷凝管下端,再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部,然后取下蒸餾液接收瓶。
六、蒸餾儀器的檢漏如何操作？
解答：可以將蒸餾裝置連接好后，在接口以及瓶塞等可能漏氣的地方滴加少量水，打開電爐加熱，觀察有無氣泡產生。
七、硼酸可以多加嗎？
解答：不可以。按國標的要求正確操作，10mL硼酸足夠。
八、滴定時消耗了很多鹽酸溶液，能否換濃度高的鹽酸溶液滴定？
解答：不能更改國標給出的滴定液濃度。蛋白質含量較高的樣品可以適當減少稱樣量，或合理范圍內減少吸取消化液的體積V3。
九、空白消耗標準滴定液的體積指的是什么？
解答：試劑空白實驗消耗的標準滴定溶液的體積就是空白體積。
十、同時有兩種蛋白怎么換算？
解答：同時含有多種蛋白質，且折算系數不相同時可以按復合配方食品換算蛋白質系數。
結語：凱氏定氮法經典、準確，適用于食品中蛋白質的測定。但是因樣品中一般會含有一些非蛋白質的含氮化合物，所以凱氏定氮法測定結果為樣品中粗蛋白質含量。然而，此法實際上測的不是蛋白質含量，而是通過測氮含量來推算出樣品中蛋白質的含量。在凱氏定氮法中消化操作的條件是產生誤差的主要原因，因此要格外注意。在實際的生產實驗中，每一步應該嚴格按照標準的規定來進行操作。本文為筆者日常工作實驗總結所得，望對實驗者有些許幫助。
