一、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的主要區(qū)別

顯微鏡的分辨率取決于所用光的波長，1933年開始出現(xiàn)的電子顯微鏡正是由于使用了波長比可見光短得多的電子束作為光源，使其所能達(dá)到的分辨率較光學(xué)顯微鏡大大提高。而光源的不同，也決定了電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的一系列差異。

根據(jù)電子束作用于樣品的方式的不同及成像原理的差異，現(xiàn)代電子顯微鏡已發(fā)展形成了許多種類型，目前最常用的是透射電子顯微鏡（transmission electron microscope）和掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope)，前者總放大倍數(shù)可在1000-1000000倍范圍內(nèi)變化，后者總放大倍數(shù)可在20-300000倍之間變化。本實(shí)驗主要介紹這兩種顯微鏡樣品的制備。

二、器材

1.菌種 大腸桿菌（大腸埃希氏菌，Escherichia coli）斜面。

2.溶液或試劑  醋酸戊脂，濃硫酸，無水乙醇，無菌水，2%磷鎢酸鈉（pH6.5-8.0）水溶液，0.3%聚乙烯甲醛（溶于三氯甲烷）溶液，細(xì)胞色素c，醋酸銨，質(zhì)粒pBR322。

3.儀器或其他用具 普通光學(xué)顯微鏡，銅網(wǎng)，瓷漏斗，燒杯，平皿，無菌滴管，無菌鑷子，大頭針，載玻片，細(xì)菌計數(shù)板，真空鍍膜機(jī)，臨界點(diǎn)干燥儀等。

三、操作步驟

（一）透射電鏡的樣品制備及觀察

1.金屬網(wǎng)的處理

光學(xué)顯微鏡的樣品是放置在載玻片上進(jìn)行觀察。而在透射電鏡中，由于電子不能穿透玻璃，只能采用網(wǎng)狀材料作為載物，通常稱為載網(wǎng)。載網(wǎng)因材料及形狀的不同可分為多種不同的規(guī)格，其中最常用的是200-400目（孔數(shù)）的銅網(wǎng)。網(wǎng)在使用前要處理，除去其上的污物，否則會影響支持膜的質(zhì)量及標(biāo)本照片的清晰度。本實(shí)驗選用的是400目的銅網(wǎng)，可用如下方法進(jìn)行處理：首先用醋酸戊酯浸漂幾小時，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，然后再將銅網(wǎng)浸漂在無水乙醇中進(jìn)行脫水。如果銅網(wǎng)經(jīng)以上方法處理仍不干凈時，可用稀釋的濃硫酸（1：1）浸1~2分鐘，或在1% NaOH 溶液中煮沸數(shù)分鐘，用蒸餾水沖洗數(shù)次后，放入無水乙醇中脫水，待用。

2.支持膜的制備

在進(jìn)行樣品觀察時，在載網(wǎng)上還應(yīng)覆蓋一層無結(jié)構(gòu)、均勻的薄膜，否則細(xì)小的樣品會從載網(wǎng)的孔中漏出去，這層薄膜通常稱為支持膜或載膜。支持膜應(yīng)對電子透明，其厚度一般應(yīng)低于20nm；在電子束的沖擊下，該膜還應(yīng)有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，并擁有良好的導(dǎo)熱性；此外，支持網(wǎng)在電鏡下應(yīng)無可見的結(jié)構(gòu)，且不與承載的樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不干擾對樣品的觀察，其厚度一般為15nm左右。支持膜可用塑料膜（如火棉膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金屬膜（如鈹膜等）。常規(guī)工作條件下，用塑料膜就可以達(dá)到要求，而塑料膜中火棉膠膜的制備相對容易，但強(qiáng)度不如聚乙烯甲醛膜。

（1）火棉膠棉的制備

在一干凈容器（燒杯、平皿或下帶止水夾的瓷漏斗）中放入一定量的無菌水，用無菌滴管吸2%火棉膠醋酸戊酯溶液，滴一滴于水面中央，勿振動，待醋酸戊酯蒸發(fā)，火膜膠則由于水的張力隨即在水面上形成一層薄膜。用鑷子將它除掉，再重復(fù)一次此操作，主要是為了清除水面上的雜質(zhì)。然后適量滴一滴火棉膠液于水面，火棉膠液滴加量的多少與形成膜的厚薄有關(guān)，待膜形成后，檢查是否有皺折，如有，則除去一直待膜制好。

所用溶液中不能有水分及雜質(zhì)，否則形成的膜的質(zhì)量較差。待膜成型后，可以側(cè)面對光檢查所形成的膜是否平整及是否有雜質(zhì)。

（2）聚乙烯甲醛膜（formvar 膜）的制備

①洗干凈的玻璃板插入0.3% formvar溶液中靜置片刻（時間視所要求的膜的厚度而定），然后取出稍稍晾干便會在玻璃板上便形成一層薄膜；

②用鋒利的刀片或針頭將膜刻一矩形；

③將玻板輕輕斜插進(jìn)盛滿無菌水的容器中，借助水的表面張力作用使膜與玻片分離并漂浮在水面上。

所使用的玻片一定要干凈，否則膜難以從上面脫落；漂浮膜時，動作要輕，手不能發(fā)抖，否則膜將發(fā)皺；同時，操作時應(yīng)注意防風(fēng)避塵，環(huán)境要干燥，所用溶劑也必需有足夠的純度，否則都將對膜的質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。

3.轉(zhuǎn)移支持膜到載網(wǎng)上

轉(zhuǎn)移支持膜到載網(wǎng)上，可有多種方法，常用的有如下二種：

（1）將洗凈的網(wǎng)放入瓷漏斗中，漏斗下套上乳膠管，用止水夾控制水流，緩緩向漏斗內(nèi)加入無菌水，其量約高1厘米；用無菌鑷子尖輕輕排除銅網(wǎng)上的氣泡，并將其均勻地擺在漏斗中心區(qū)域；按2所述方法在水面上制備支持膜，然后松開水夾，使膜緩緩下沉，緊緊貼在銅網(wǎng)上；將一清潔的濾紙覆蓋地漏斗上防塵，自然干燥或紅外線燈下烤干。干燥后的膜，用大頭針尖在銅網(wǎng)周圍劃一下，用無菌鑷子小心將銅網(wǎng)膜移到載玻片上，置光學(xué)顯微鏡下用低倍鏡挑選完整無缺、厚薄均勻的銅網(wǎng)膜備用。

（2）按2所述方法在平皿或燒杯里制備支持膜，成膜后將幾片銅網(wǎng)放在膜上，再在上面放一張濾紙，浸透后用鑷子將濾紙反轉(zhuǎn)提出水面。將有膜及銅網(wǎng)的一面朝上放在干凈平皿中，置40℃烘箱使干燥。

4.制片

  透射電鏡樣品的制備方法很多，如超薄切片法、復(fù)型法、冰凍蝕刻法、滴液法等。其中滴液法，或在滴液法基礎(chǔ)上發(fā)展出來的其他類似方法如直接貼印法、噴霧法等主要被用于觀察病毒粒子、細(xì)菌的形態(tài)及生物大分子等。而由于生物樣品主要由碳、氫、氧、氮等元素組成，散射電子的能力很低，在電鏡下反差小，所以在進(jìn)行電鏡的生物樣品制備時通常還須采用重金屬鹽染色或金屬鹽噴鍍等方法來增加樣品的反差，提高觀察效果。例如負(fù)染色法就是用電子密度高，本身不顯示結(jié)構(gòu)且與樣品幾乎不反應(yīng)的物質(zhì)（如磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀）來對樣品進(jìn)行“染色”。由于這些重金屬鹽不被樣品萬分所吸附而是沉積到樣品四周，如果樣品具有表面結(jié)構(gòu)，這種物質(zhì)還能穿透進(jìn)表面上凹陷的部分，因而在樣品四周有染液沉積的地方，散射電子的能力強(qiáng)，表現(xiàn)為暗區(qū)，而在有樣品的地方散射電子的能力弱，表現(xiàn)為亮區(qū)。這樣便能把樣品的外形與表面結(jié)構(gòu)清楚地襯托出來。負(fù)染色法由于操作簡單，目前在進(jìn)行透射電鏡生物樣品制片時比較常用。本實(shí)驗將主要介紹采用滴液法結(jié)合負(fù)染色技術(shù)觀察細(xì)菌及核酸分子的形態(tài)。

（1）細(xì)菌的電鏡樣品制備

①將適量無菌水加入生長良好的細(xì)菌斜面內(nèi)，用吸管輕輕撥動菌體制成菌懸液。用無菌濾紙過濾，并調(diào)整濾液中的細(xì)胞濃渡為108~109個/亳升。

②取等量的上述菌懸液與等量的2%的磷鎢酸鈉水溶液混合，制成混合菌懸液。

③用菌毛細(xì)吸管吸取混合菌懸液滴在銅網(wǎng)膜上。

④經(jīng)3~5分鐘后，用濾紙吸去余水，待樣品干燥后，置低倍光學(xué)顯微鏡下檢查，挑選膜完整、菌體分布均勻的銅網(wǎng)。

有時為了保持菌體的原有形狀，常用戊二醛、甲醛、鋨酸蒸氣等試劑小固定后再進(jìn)行染色。其方法是將用無菌水制備好的菌懸液經(jīng)過過濾，然后向濾液中加幾滴固定液（如pH7.2，0.15%的戊二醛磷酸緩沖液），經(jīng)這樣預(yù)先稍加固定后，離心，收集菌體，再用無菌水制成菌懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為108-109個/毫升。然后按上述方法染色。

（2）核酸分子的電鏡樣品制備

核酸分子鏈一般較長，采用普通的滴液或噴霧法易使其結(jié)構(gòu)受到破壞，因此目前多采用蛋白質(zhì)分子膜技術(shù)來進(jìn)行核酸分子樣品的制備。其原理是：很多球狀蛋白均能在水溶液或鹽溶液的表面形成不溶的變性薄膜，在適當(dāng)?shù)臈l件下這一薄膜可以成為單分子層，由伸展的肽鏈構(gòu)成一個分子網(wǎng)。當(dāng)核酸分子與該蛋白質(zhì)單分子膜作用時，會由于蛋白質(zhì)的氨基酸堿性側(cè)鏈基團(tuán)的作用，使得核酸從三維空間結(jié)構(gòu)的溶液構(gòu)型吸附于肽鏈網(wǎng)而轉(zhuǎn)化為二維空間的構(gòu)型，并從形態(tài)到結(jié)構(gòu)均能保持一定程度的完整性。最后將吸附有核酸分子的蛋白質(zhì)單分子膜轉(zhuǎn)移到載膜上，用負(fù)染等方法增加樣品的反差后置電鏡觀察。可用展開法、擴(kuò)散法、一步稀釋法等使核酸吸附到蛋白質(zhì)單分子膜上，本實(shí)驗采用展開法。

①將質(zhì)粒pBR322與一堿性球狀蛋白溶液（一般為細(xì)胞色素c）混合，使?jié)舛确謩e達(dá)到0.5-2 mg/ml和0.1mg/ml，并加入終濃度為0.5-1mol/L的醋酸銨和1mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉，成為展開溶液，pH為7.5。

②在一干凈的平皿中注入一定下相溶液（蒸餾水或0.1-0.5mol/L的醋酸銨溶液），并在液面上加入少量滑石粉。將一干凈載玻片斜放于平皿中，用微量注射器或移液槍吸取50μl的展開溶液，在離下相溶液表面約1cm左右的載玻片上前后擺動，滴于載玻片的表面，此時可看到滑石粉層后退，說明蛋白質(zhì)單分子膜逐漸形成，整個過程約需2-3min。載玻片傾斜的角度決定了展開液下滑至下相溶液的速度，并對單分子膜的形成質(zhì)量有影響，經(jīng)驗證明傾斜度以150左右為宜。在蛋白形成單分子膜時，溶液中的核酸分子也同時分布于蛋白質(zhì)基膜中間，并略受蛋白質(zhì)肽鏈的包裹。理論計算及實(shí)驗證明，當(dāng)1mg的蛋白質(zhì)展開成良好的單分子膜時，其面積約為1cm2，因而可根據(jù)最后形成的單分子膜面積的大小估計其好壞程度。如果面積過小，說明形成的膜并非單分子層，因而核酸就有局部或全部被膜包裹的危險，使整個核酸分子消失或反差變壞。

在單分子膜形成時整個裝置最好用玻璃罩等物蓋住，以防操作人員的呼吸和旁人走動等引起氣流的影響以及灰塵等臟物的污染。另外，在展開溶液中可適量加入一些與核酸量相差不過懸殊的指示標(biāo)本，如煙草花葉病病毒等，以利于鑒定單分子膜的展開及后面轉(zhuǎn)移的好壞。

③單分子膜形成后，用電鏡鑷子取一覆有支持膜的載網(wǎng)，使支持膜朝下，放置于離單分子膜前沿1cm或距載玻片0.5cm的膜表面上，并用鑷子即刻撈起，單分子膜即吸附于支持膜上。多余的液體可用小片濾紙吸去，也可將載網(wǎng)直接漂浮于無水乙醇中10-30s。

④將載有單分子膜的載網(wǎng)置于10-3-10-5mol/L的醋酸鈾乙醇溶液中染色約30s（此步可在用乙醇脫水時同時進(jìn)行），或用旋轉(zhuǎn)投影的方法將金屬噴鍍于核酸樣品的表面。也可將二種方法結(jié)合起來，在染色后再進(jìn)行投影，其效果有時比單獨(dú)使用一種方法更好一些。

5.觀察

將載有樣品的銅網(wǎng)置于透射電鏡中進(jìn)行觀察。
（二） 掃描電鏡微生物樣品的制備及觀察

掃描電鏡觀察時要求樣品必需干燥，并且表面能夠?qū)щ姟Ｒ虼耍�在進(jìn)行掃描電鏡微生物樣品制備時一般都需采用固定、脫水、干燥及表面鍍金等處理步驟。

1.固定及脫水

生物樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)易遭破壞，因此在進(jìn)行制樣處理和進(jìn)行電鏡觀察前必需進(jìn)行固定，以使其能最大限度地保持其生活時的形態(tài)。而采用水溶性、低表面張力的有機(jī)溶液如乙醇等對樣品進(jìn)行梯度脫水，也是為了在對樣品進(jìn)行干燥處理時盡量減少由表面張力引起的其自然形態(tài)的變化。

將處理好的、干凈的蓋玻片，切割成4-6mm2的小塊，將待檢的較濃的大腸桿菌懸浮液滴加其上，或?qū)⒕�苔直接涂上，也可用蓋玻片小塊粘貼菌落表面，自然干燥后置光學(xué)顯微鏡鏡檢，以菌體較密，但又不堆在一起為宜；標(biāo)記蓋玻片小塊有樣品的一面；將上述樣品置于1%-2%戊二醛磷酸緩沖液（pH7.2左右）中，于40度冰箱中固定過夜。次日以0.15%的同一緩沖液沖洗，用40%、70%、90%和100%的乙醇分別依次脫水，每次15min。脫水后，用醋酸戊脂置換乙醇。

另一種與之類似的樣品制備方法是采用離心洗滌的手段將菌體依次固定及脫水，最后涂布到玻片上。其優(yōu)點(diǎn)是：①在固定及脫水過程中可完全避免菌體與空氣接觸，從而可最大程度地減少因自然干燥而引起的菌體變形；②可保證最后制成的樣品中有足夠的菌體濃度，因為涂在玻片上的菌體在固定及干燥過程中有時會從玻片上脫落；③確保玻片上有樣品的一面不會弄錯。

2.干燥

將上述制備的樣品置于臨界點(diǎn)干燥器中，浸泡于液態(tài)二氧化碳中，加熱到臨界點(diǎn)溫度（31.40，72.8個大氣壓）以上，使之氣化進(jìn)行干燥。

樣品經(jīng)脫水后，有機(jī)溶劑排擠了水分，侵占了原來水的位置。水是脫掉了，但樣品還是浸潤在溶劑中，還必需在表面張力盡可能小的情況下將這些溶劑“請”出去，使樣品真正得到干燥。目前采用最多、效果最好的方法是臨界點(diǎn)干燥法。其原理是在一裝有溶液的密閉容器中，隨著溫度的升高，蒸發(fā)速率加快，氣相密度增加，液相密度下降。當(dāng)溫度增加到某一定值時，氣、液二相密度相等，界面消失，表面張力也就不存在了。此時的溫度及壓力即稱為臨界點(diǎn)。將生物樣品用臨界點(diǎn)較低的物質(zhì)置換出內(nèi)部的脫水劑進(jìn)行干燥，可以完全消除表面張力對樣品結(jié)構(gòu)的破壞。目前用得最多的置換劑是二氧化碳。由于二氧化碳與乙醇的互溶性不好，因此樣品經(jīng)乙醇分級脫水后還需用與這兩種物質(zhì)都能互溶的“媒介液”醋酸戊脂置換乙醇。

3.噴鍍及觀察

將樣品放在真空鍍膜機(jī)內(nèi)，把金噴鍍到樣品表面后，取出樣品在掃描電鏡中進(jìn)行觀察。