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3M環(huán)境李斯特菌測(cè)試片操作以及判讀 | ||
| 一、測(cè)試環(huán)境李斯特菌數(shù) 操作方法 | |||
 1. 將未開封的測(cè)試片貯藏在<= 8 oC (46 oF)的環(huán)境下，并在包裝上標(biāo)示的有效期內(nèi)使用。在高濕度的地方，最好在使用前將測(cè)試片回復(fù)到室溫。 |
 2. 已開封的測(cè)試片，將開口反折，用膠帶封好。 |
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 3. 為防止暴露于潮濕的環(huán)境中，請(qǐng)不要冷藏已開封的測(cè)試片。將膠帶封好的測(cè)試片貯藏在低溫干燥的地方，保持時(shí)間不超過1個(gè)月。請(qǐng)勿將測(cè)試片放在溫度> 25 oC (77 oF)和(或)相對(duì)濕度> 50%的環(huán)境中。 |
 4. 用涂抹棒、海棉或其它采樣設(shè)備收集環(huán)境樣本。濕潤(rùn)采樣設(shè)備的液體應(yīng)<= 10 mL。濕潤(rùn)劑可以是無菌水、緩沖蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)，或中和緩沖液，如Letheen肉湯或Dey/Engley (DE)中和肉湯。 |
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 5. 在無菌環(huán)境下在收集的樣品中添加5 mL，20-30oC，滅過菌的緩沖蛋白胨水(BPW)溶液。 不要將Petrifilm EL測(cè)試片與Vermont 培養(yǎng)基(UVM)、Fraser肉湯、李斯特菌增菌培養(yǎng)基 (LEB)或緩沖李斯特菌增菌培養(yǎng)基(BLEB)共用。 |
 6. 混合，蠕動(dòng)或旋轉(zhuǎn)樣品與BPW的混合液將近一分鐘。將樣品置于室溫(20-30 oC) 1h，最久不超過1.5 h，以修復(fù)損傷的李斯特菌。 |
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 7. 將測(cè)試片置于平坦表面處，揭開上層膜。 |
 8. 用3MTM電子移液槍或其它移液器垂直滴加3 mL樣品到下層膜的中央。 |
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 9. 將上層膜緩慢蓋下，以免產(chǎn)生氣泡。 |
 10. 輕輕地將塑料壓板放在位于接種區(qū)上層膜上。不要壓，扭轉(zhuǎn)或滑動(dòng)壓板。提起壓板。等至少10分鐘，以使膠體凝固。 |
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 11. 將測(cè)試片透明面朝上，可疊放至10片，在35oC ± 1oC或37oC ± 1oC下培養(yǎng)28h ± 2 h。 |
 12. Petrifilm EL測(cè)試片能夠用標(biāo)準(zhǔn)的菌落計(jì)數(shù)器或其它光學(xué)放大器計(jì)數(shù)或判讀。不要計(jì)數(shù)圓形輪廓上的菌落，因?yàn)樗鼈儾皇苓x擇性培養(yǎng)基的作用。 |
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Petrifilm EL測(cè)試片法可用于定性、半定量及定量檢測(cè)
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13. 對(duì)于定性檢測(cè)，根據(jù)紫紅色菌落的存在與否，將結(jié)果計(jì)為檢出和未檢出。 如果是/否的結(jié)果已經(jīng)能夠滿足報(bào)告要求，那么你可以選擇定性檢測(cè)。 |
 14. 對(duì)于半定量檢測(cè)，根據(jù)出現(xiàn)紫紅色菌落的相對(duì)量來記錄結(jié)果。 如果你是根據(jù)菌落數(shù)的相對(duì)含量來采取相應(yīng)的措施，并且沒必要記錄實(shí)際菌落數(shù)，那么你可以選擇半定量檢測(cè)。李斯特菌的含量應(yīng)記錄為對(duì)采樣區(qū)域和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有指導(dǎo)意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受) |
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未檢出
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檢出
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 15. 對(duì)于定量檢測(cè)，計(jì)數(shù)所有紫紅色菌落。 如果你根據(jù)菌落數(shù)來采取相應(yīng)的措施，你可以采用定量檢測(cè)。測(cè)試片上李斯特菌數(shù)：16請(qǐng)參考判讀手冊(cè)的“定量采樣與判讀”部分來計(jì)算每個(gè)環(huán)境樣本中的李斯特菌數(shù)。 |
 16. 可挑區(qū)菌落進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。掀起上層膜，從膠上挑取菌落。 |
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定量采樣與判讀
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如果你以定量方式使用3M Petrifilm EL 測(cè)試片，請(qǐng)參考產(chǎn)品的包裝插件，然后按下述方式計(jì)算單位面積的菌落數(shù)(Colony Forming Units, CFU)。同時(shí)，你也要注意以下幾點(diǎn)： 1.穩(wěn)定性是在環(huán)境監(jiān)控過程中獲得有用信息的關(guān)鍵點(diǎn)，所以在采樣過程中應(yīng)使用相同的步驟。理想情況下，應(yīng)使用相同類型的取樣設(shè)備，模板面積，技術(shù)員和采樣技術(shù)。 為了測(cè)定單位采樣面積的李斯特菌數(shù)，你需要記錄以下數(shù)據(jù)： |
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或
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| 環(huán)境定量采樣符合以下文獻(xiàn)： Standard Methods for the Examination of Dairy Products, Section 3.7D, American Public Health Association, Washington D. C., 1992. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, Section 3.512 and 3.521, American Public Health Association, Washington D. C., 2001 |
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定量判讀
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 1. 用10 mL液體濕潤(rùn)海綿，涂抹采樣面，如面積為1平方英尺(1 ft2)。 |
 2. 將海綿放回?zé)o菌容器，加入5 mL緩沖蛋白胨水(BPW)。 |
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 3. 修復(fù)完成后，吸取3 mL混合液接種到Petrifilm EL測(cè)試片。 |
 4. 培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù) (在本例中，假設(shè)菌落數(shù)為90)。 |
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 1. 用1 mL液體濕潤(rùn)涂抹頭，涂抹采樣面，如面積為50平方厘米(50 cm2). |
 2. 將涂抹棒放回?zé)o菌容器中，添加5 mL緩沖蛋白胨水(BPW)。 |
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 3. 修復(fù)完成后，吸取3 mL混合液接種到Petrifilm EL 測(cè)試片。 |
 4. 培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù) (在本例中，假如菌落數(shù)為90)。 |
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| 二、測(cè)試環(huán)境李斯特菌 判讀方法 | |||
| 3MTM PetrifilmTM Environmental Listeria(EL) 測(cè)試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基，含有選擇性試劑，營(yíng)養(yǎng)成分，冷水可溶性的凝膠和有助于菌落檢測(cè)的顯色指示劑。Petrifilm EL 測(cè)試片可用于檢測(cè)或計(jì)數(shù)環(huán)境樣本中的李斯特菌數(shù)。Petrifilm EL 測(cè)試片檢測(cè)的李斯特菌包括單核增生李斯特菌(L.monocytogenes) 英諾克李斯特菌 (L.innocua)，格氏/墨氏李斯特菌(L.grayi/murrayi)，威爾李斯特菌(L.welshimeri)，但不能區(qū)分各種菌。 環(huán)境條件和消毒劑可能會(huì)抑制或損傷微生物。緩沖蛋白胨緩沖液(Buffered Peptone Water, BPW) 能用作修復(fù)肉湯和Petrifilm EL測(cè)試片結(jié)合使用。但李斯特菌在緩存蛋白胨緩沖液中的修復(fù)過程不是增菌步驟。 |
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 1. 圖1 為長(zhǎng)有李斯特菌的典型Petrifilm EL 測(cè)試片。判讀或計(jì)數(shù)所有的紫紅色菌落為李斯特菌。如果在26-29 小時(shí)，有灰色或淡粉紅色菌落存在，需繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，由灰色或淡粉紅色加深為紫紅色的菌落應(yīng)判定為李斯特菌。在最大培養(yǎng)時(shí)間(30小時(shí))仍保持灰色或淡粉紅色的菌落不應(yīng)判讀為李斯特菌。不考慮或計(jì)數(shù)圓形輪廓上的菌落，因?yàn)樗鼈儾皇苓x擇性培養(yǎng)基的作用。定性判讀： 測(cè)試片檢出李斯特菌。 半定量判讀：李斯特菌的含量應(yīng)記錄為對(duì)采樣區(qū)域和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有指導(dǎo)意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。 定量判讀： 測(cè)試片上的李斯特菌數(shù)：11。 請(qǐng)參考判讀手冊(cè)的“定量采樣與判讀”部分來計(jì)算每個(gè)環(huán)境樣本中的李斯特菌數(shù)。 |
 2. 該P(yáng)etrifilm EL 測(cè)試片在培養(yǎng)30小時(shí)后沒有菌落生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。定性判讀： 測(cè)試片上未檢出李斯特菌。 半定量判讀：李斯特菌的含量應(yīng)記錄為對(duì)采樣區(qū)域和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有指導(dǎo)意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。 定量判讀：測(cè)試片上的李斯特菌數(shù)：< 1。 請(qǐng)參考判讀手冊(cè)的“定量采樣與判讀”部分來計(jì)算每個(gè)環(huán)境樣本中的李斯特菌數(shù)。 |
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 3. Petrifilm EL測(cè)試片對(duì)李斯特菌具有選擇性，其菌落顯示為紫紅色。定性判讀： 測(cè)試片上檢出李斯特菌。 半定量判讀：李斯特菌的含量應(yīng)記錄為對(duì)采樣區(qū)域和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有指導(dǎo)意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。 定量判讀：測(cè)試片上的李斯特菌數(shù)：84 。 請(qǐng)參考判讀手冊(cè)的“定量采樣與判讀”部分來計(jì)算每個(gè)環(huán)境樣本中的李斯特菌數(shù)。 |
 4. 由于Petrifilm EL測(cè)試片的判讀方式有三種，所以沒有建議的計(jì)數(shù)范圍。當(dāng)菌落密集時(shí)，按以下方式判讀定性或半定量的結(jié)果，或估算定量的結(jié)果。定性判讀：測(cè)試片上檢出李斯特菌。 半定量判讀：李斯特菌的含量應(yīng)記錄為對(duì)采樣區(qū)域和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有指導(dǎo)意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。 定量判讀：測(cè)試片上估算的李斯特菌數(shù)：約460。當(dāng)大量李斯特菌存在時(shí)，通過計(jì)數(shù)兩個(gè)或兩個(gè)以上的具有代表性方格的菌落數(shù)來估算。計(jì)算每個(gè)方格的平均菌落數(shù)數(shù)后乘以42。Petrifilm EL測(cè)試片的接種面積近似42 cm2。 |
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 5. 當(dāng)菌落數(shù)很多時(shí)，測(cè)試片上可能有許多小的，不清楚的菌落，和(或) 呈現(xiàn)全部的粉紅色至棕色。定性判讀：測(cè)試片上檢出李斯特菌。 半定量判讀：李斯特菌的含量應(yīng)記錄為對(duì)采樣區(qū)域和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有指導(dǎo)意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。 定量判讀：測(cè)試片上的李斯特菌數(shù)為多不可計(jì)(Too Numerous To Count, TNTC)。該圖中的菌落數(shù)近似104。 |
 6. 背景顏色可能會(huì)因?yàn)榄h(huán)境樣本中的灰塵、泥土、砂子、或其它沉淀物而發(fā)生變化，也可能是因?yàn)椴蓸釉O(shè)備和(或) 緩沖蛋白胨水(修復(fù)液)的品牌不同而引起。紫紅色菌落判讀為李斯特菌。定性判讀：測(cè)試片上檢出李斯特菌。 半定量判讀：李斯特菌的含量應(yīng)記錄為對(duì)采樣區(qū)域和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有指導(dǎo)意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。 定量判讀：測(cè)試片上的李斯特菌數(shù)：11。 請(qǐng)參考判讀手冊(cè)的“定量采樣與判讀”部分來計(jì)算每個(gè)環(huán)境樣本中的李斯特菌數(shù)。 |
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