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一、試劑/溶劑
其次是水，水中的雜質(zhì)是干擾峰的主要來源之一，這是大家極易忽視的問題。采集波長較低的檢測方法，建議使用高品質(zhì)水，這樣可以避免很多因為水質(zhì)帶來的問題。再次是各種鹽類，這也是色譜干擾峰的主要來源之一。如圖2所示，與圖1相比，如圖2加入磷酸二氫鉀后，16.5min處出現(xiàn)干擾峰。對于無機(jī)鹽引入的干擾峰，在方法開發(fā)初期一般就會特別關(guān)注，尋找解決方案。方法確定后，鹽的品種及級別也同時確定，因此鹽對方法的影響基本可控。 水和無機(jī)鹽引起的干擾峰，比較快捷的解決方案是安裝鬼峰補(bǔ)集柱，這樣可以有效的避免此類干擾。如果使用離子對試劑，則需選擇不影響離子對試劑的鬼峰補(bǔ)集柱。
再次樣品前處理過程中接觸的器材。前處理過程中接觸的器材主要包括容量瓶、濾頭、注射器及進(jìn)樣瓶。容量瓶的清洗同流動相瓶、過濾裝置一樣，要建立良好的清洗規(guī)程。移液器材以及濾頭、注射器，多為塑料制品，其化學(xué)惰性較玻璃制品差，因此容易引入干擾峰。如下圖4、圖5、圖6所示案例，此方法檢測波長為210納米，溶劑為正己烷-異丙醇（90:10），溶劑分別接觸移液槍槍頭、一次性吸管、一次性注射器后，均引入不同的干擾峰。
進(jìn)樣小瓶若為一次性使用，一般不會引入干擾峰。如果進(jìn)樣瓶反復(fù)清洗，多次使用，則應(yīng)建立清洗規(guī)程并對其清洗干凈程度進(jìn)行確認(rèn)。
與前兩類干擾峰相比，液相系統(tǒng)干擾峰的解決更加困難。液相系統(tǒng)是一個動態(tài)過程，所以此類問題解決過程耗費時間長，而且要求實驗人員有很高的色譜素養(yǎng)。對此類問題來源主要歸結(jié)為三類：強(qiáng)保留物質(zhì)、離子對污染和管路滋生細(xì)菌。首先是強(qiáng)保留物質(zhì)的干擾，其主要特征是寬峰。此類問題多數(shù)發(fā)生在等度洗脫中，梯度洗脫主要出現(xiàn)在高比例有機(jī)相處。這是由于強(qiáng)保留物質(zhì)在當(dāng)次進(jìn)樣中未洗脫出，在后續(xù)進(jìn)樣洗脫出來所致。如圖7中9分鐘處的色譜峰。
對于此類干擾峰，可通過延長采集時間或增加洗脫強(qiáng)度來消除對后續(xù)樣品的干擾。 系統(tǒng)干擾峰第二個方面是離子對、螯合劑這種難以洗脫的試劑對液相系統(tǒng)的污染。此類污染物多半是由于使用完畢含有離子對、螯合劑之類的流動相后，對系統(tǒng)的沖洗不徹底所致。此類污染物主要對一些采集波長較低的方法產(chǎn)生干擾，普遍表現(xiàn)是基線噪音大或者干擾峰，但隨著方法的運行會逐漸趨于正常。 系統(tǒng)干擾峰第三個方面是系統(tǒng)滋生細(xì)菌。對于系統(tǒng)滋生細(xì)菌，多數(shù)讀者可能覺得不可思議，因為液相系統(tǒng)使用完畢都會用有機(jī)相沖洗保存。目前很多方法流動相A都是水相，雖然水相每日都會新配制，但如果由濾頭到比例閥這一段管路長時間在水相中就會滋生細(xì)菌。隨著時間的運行，梯度洗脫中會逐漸的產(chǎn)生干擾峰。此類問題雖然比較隱蔽，但比較容易解決，只要每日對放置純水相的通道用有機(jī)相沖洗即可避免此類問題。 實際工作中，色譜工作者遇到的最大困難是如何識別判斷干擾峰屬于哪一類。由于找不清問題根源，所以也就難以有針對性的解決問題。
異常的色譜峰指的是色譜圖中的無峰或出現(xiàn)負(fù)峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對稱等情況。異常峰是色譜實驗工作中最棘手的問題。這些峰嚴(yán)重影響色譜分析的結(jié)果。色譜圖中不可能有純正的高斯對稱峰 , 輕微的拖尾是正常的 , 這是由分離系統(tǒng)所決定的。在此僅對幾種異常峰進(jìn)行分析。
產(chǎn)生原因大致分為以下幾種情形 (1) 樣品不純。可改變不同的流動相和色譜柱 ,對樣品進(jìn)行分離比較 , 選擇合適的分離條件。 (2) 分析柱或保護(hù)柱柱頭塌陷。此情況較常見 ,可更換分析柱或保護(hù)柱后對峰形進(jìn)行比較。柱頭塌陷時往往所有的峰都會出現(xiàn)峰分裂 。對色譜柱再生和清洗可以改善分離效果。 (3) 色譜柱柱容量下降。當(dāng)長時間使用后 , 有一些強(qiáng)保留組分吸附在柱子中 , 不大的進(jìn)樣量往往就會出現(xiàn)峰分裂。用強(qiáng)洗脫能力的溶劑清洗色譜柱 , 或更換色譜柱可使問題得到改善。 (4) 樣品溶劑與流動相不匹配或進(jìn)樣體積過大。當(dāng)樣品溶劑比流動相極性大時 , 有時即使進(jìn)樣體積很小 , 也容易出現(xiàn)峰變形和裂分現(xiàn)象。建議用流動相溶解樣品。 (5) 流動相不恰當(dāng)。此情況較罕見 , 有些樣品在特定的色譜條件下可能存在結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡 , 而出雙峰 , 這種雙峰是無法分離完全的 , 改變色譜條件尤其是p H 值會使峰形正常。 (6) 樣品分解。不穩(wěn)定的樣品在色譜分離過程中變成其他物質(zhì)而出現(xiàn)雙峰。這時需改變樣品處理方法或色譜分離條件。
在色譜分析中有時會出現(xiàn)負(fù)峰或倒峰 , 大峰的左下就有一負(fù)峰。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由以下幾種原因引起的 , 可針對不同情況進(jìn)行排除 , 進(jìn)而使問題得到解決。 (1) 流動相吸收本底值過高。此時可適當(dāng)改變檢測波長。 (2) 進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣。進(jìn)行排氣處理 , 直到基線平穩(wěn)再進(jìn)樣。 (3) 樣品組分的吸收低于流動相�？筛淖兞鲃酉嗷蚋淖儥z測波長。 (4) 配制樣品的溶液與流動相不一樣。重新配制樣品 , 用與流動相一樣的溶劑配制或稀釋樣品。
拖尾：1 干擾峰，優(yōu)化條件分離 ；2 色譜柱塌陷，更換色譜柱；3 流動相pH不合適，調(diào)節(jié)pH值 ；4 管路沒有接好，存在較大的死體積，可以重新接一下。 前沿：1 溶劑選擇不合適，選擇合適的溶劑 ；2 樣品過載，降低進(jìn)樣量；3 柱溫太低，升高柱溫 ；4 色譜柱損壞，更換色譜柱 ； 圖譜前沿和拖尾的原因主要是流動相選擇不合適，可以相應(yīng)調(diào)整流動相的極性，或者適當(dāng)加入酸來調(diào)整，可以得到較好的改善。一般來講，酸堿在流動相中對于前沿和拖尾影響較大。 柱前沿是可能因為柱超載，拖尾是可能因為樣品被污染，選擇合適的流動相，調(diào)節(jié)好PH能夠改善這以情況。 前輩們總是會告訴我們，拖尾峰與柱子有關(guān)，可能是過載，稀釋樣品再做，或換新柱做。 有時候托尾峰往往是有機(jī)性相近雜質(zhì)沒有分開，此時，可以優(yōu)化分析方法，或更換柱子試一試；也可能由于柱子使用時間太久柱效下降出現(xiàn)塌陷等原因；再有也會根樣品本身性質(zhì)有關(guān)，基團(tuán)需要流動相中添加能與之結(jié)合優(yōu)化峰形的化學(xué)物質(zhì)，要根據(jù)具體情況而定。
液相上有一句經(jīng)典的話說得好 “出兩個峰肯定不是一種物質(zhì)，出一個峰不一定是一種物質(zhì)”。 而色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。我將這種情況分為四種原因。 （1）色譜柱 如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質(zhì)時，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，高頻紅外碳硫分析儀這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報廢。 （2）溶劑極性及進(jìn)樣量 許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。 當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰�。看味疾惶粯樱彝衔玻Ａ魰r間會提前（相對進(jìn)樣量少而言），將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎！＿@是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。 （3）樣品的特性 有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個動態(tài)平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質(zhì)譜檢測器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。 （4）參數(shù) 記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如C－R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC 為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變?yōu)槎䝼�峰或更多。
高效液相色譜法中，常用的試劑主要是有機(jī)溶劑、各種鹽類及水。有機(jī)溶劑一般多為購買的色譜級，所以出現(xiàn)問題的幾率較小。但是分裝出的有機(jī)溶劑，由于多次使用，被污染的概率較大，因此引入干擾峰的幾率較高。
二、器材
干擾峰來源的第二個方面是流動相配制及樣品前處理過程中接觸的各種器材。
首先是流動相配制過程中接觸的器材，包括燒杯、玻璃棒、pH計、濾杯、濾膜、流動相瓶等。燒杯、玻璃棒是配制流動相首先接觸的器材，因此建議配制流動相的燒杯、玻璃棒專用。濾杯實驗人員只要清洗干凈一般不會帶來污染。需要注意的是，如果過濾含有離子對的流動相，建議增加清洗次數(shù)，避免清洗不干凈污染后續(xù)流動相。因此，對濾杯的清洗應(yīng)該建立基本的洗滌規(guī)程，保證實驗人員對使用的器材清洗到位。濾膜也是干擾峰引入源頭之一。
如圖3所示，乙腈經(jīng)過有機(jī)系濾膜過濾后，在梯度洗脫中會引入較大干擾峰。鑒于色譜級試劑廠家已經(jīng)過膜，且多數(shù)儀器都有脫氣機(jī)，所以筆者建議無需再對甲醇、乙腈等純有機(jī)相過濾。流動相瓶引入干擾峰的現(xiàn)象主要出現(xiàn)在夏季，這是由于夏季溫度高，純水相容易滋生細(xì)菌。后續(xù)的流動相瓶使用人員清洗不到位，所以導(dǎo)致引入干擾峰。因此流動相瓶的清洗要建立嚴(yán)格的洗滌規(guī)程。
三、液相系統(tǒng)
異常的色譜峰產(chǎn)生的原因
1、峰前或峰后有小峰的分析
2、負(fù)峰分析
3、前沿、拖尾峰分析
4、色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理
