定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR）是應(yīng)用于以RNA作為起始材料的PCR實(shí)驗(yàn)中的一種實(shí)驗(yàn)方法。在該方法中，總RNA或信使RNA（mRNA）首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。隨后，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中，其中包括基因表達(dá)分析、RNA干擾驗(yàn)證、微陣列驗(yàn)證、病原體檢測、基因測試和疾病研究。

RT-qPCR的一步法與兩步法

RT-qPCR可通過一步法或兩步法來完成。一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起，使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。在兩步法RT-qPCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過程是在兩個管中完成，使用不同的優(yōu)化的緩沖液、反應(yīng)條件、以及引物設(shè)計(jì)策略。

一步法

優(yōu)點(diǎn)：

1. 由于兩步反應(yīng)都在一個管中完成，因此該方法具有更少的實(shí)驗(yàn)誤差；

2. 更少的移液步驟能夠減少污染的風(fēng)險；

3. 適用于高通量擴(kuò)增/篩選，快速且可重現(xiàn)性高。

缺點(diǎn)：

1. 無法分別對兩步反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化；

2. 由于反應(yīng)條件是結(jié)合兩步反應(yīng)折中得到的，因此靈敏性不如兩步法；

3. 單一樣品檢測的靶點(diǎn)數(shù)較少。

兩步法

優(yōu)點(diǎn)：

1.能夠建立可以長期保存，并用于多次反應(yīng)的穩(wěn)定的cDNA庫；

2. 靶基因和內(nèi)參基因能夠從同一個cDNA庫進(jìn)行擴(kuò)增，而不需要多重cDNA庫；

3.能夠優(yōu)化單一反應(yīng)過程的反應(yīng)緩沖液和反應(yīng)條件；

4. 靈活的引發(fā)條件選擇。

缺點(diǎn)：

1. 使用多個試管，以及更多的移液步驟會增加DNA污染的風(fēng)險，并且耗時；
2. 相較于一步法，需要進(jìn)行更多的優(yōu)化。