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373A型DNA測序儀的原理

放大字體  縮小字體 發布日期:2010-12-11  來源:丁香通
核心提示:373A型DNA測序儀的原理

 DNA序列測定是分子生物學領域最重要的技術之一,是了解基因結構和功能的基礎。DNA測序技術的不斷完善和儀器自動化程度的不斷提高,為大型基因組測序奠定了基礎,當今大多數蛋白質序列都是通過基因或cDNA的核苷酸序列推導出來的。DNA測序方法主要有雙脫氧鏈終止法(Sanger法)和化學降解法(Maxam-Gilbert法)。目前不管是傳統的手工測序法,還是儀器自動測序法均使用前者,而儀器自動測序法以其快速、準確等優點得以廣泛應用。我室于1995年,引進美國PE公司的373A型DNA序列測定儀,儀器專管共用,兩年來為校內、外科研人員提供測序服務,現將該儀器使用中的一點體會報告如下。

1、測序原理和特點

373A型DNA測序儀使用雙脫氧鏈終止法(Dye-primer或Dye-terminator)進行DNA測序反應,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,實時檢測自動讀序。該儀器與其它儀器相比較,其顯著特點是它能用4種不同的熒光分子分別標記4種反應引物(Dye-primer法)或4種dNTP(Dye-terminator法)。4個反應分開進行,產物合并在一個泳道中電泳分離,根據每條區帶的熒光不同加以識別讀序,這樣不但可提高每次分析樣品的數量(373A型每次可測定36個樣品),又克服了泳道間差異造成的讀序誤差。與傳統的手工測序比較:①安全,無污染;用熒光素代替同位素,避免了放射性同位素的污染和對人體的危害;②模板用量大大減小,單鏈DNA模板用量為0.4μg,雙鏈DNA質粒模板用量為0.8μg,PCR產物用量為5ng~20ng;③測序長度大大提高,一般可達450bp~500bp。

2、體會

2.1 模板純化是前提 DNA測序所用的模板可以是質粒DNA,也可以是PCR產物,但使用高質量的模板是測序成功的前提。DNA純化的方法很多,如聚乙二醇沉淀法、瓊脂糖凝膠電泳法、氯化銫梯度離心法、高效液相色譜法(HPLC法)和一次性微柱法等。用這些方法純化的DNA都可用于DNA測序,但從我們實驗結果來看,HPLC法和微柱法(如Promega公司的Wizard Plus Miniprep DNA Purification System)效果最好。為了保證測序的成功率,測序模板純化后,必須先進行1%瓊脂糖凝膠電泳(凝膠中含0.5mg/L溴化乙錠,樣品濃度為0.2g/L,上樣量為1μl)鑒定其純度,要求條帶清晰,無雜帶,無拖尾,否則應重新純化,以保證測序的結果。

2.2 測序反應是關鍵 測序反應是DNA自動測序的第一步,也是測序成敗的關鍵所在。符合測序要求的DNA模板,經過測序反應后,會形成數百條帶有不同熒光的核苷酸鏈,且每條核苷酸鏈的堿基數只相差1個堿基。目前,我們使用的測序試劑為PE公司提供的DNA測序試劑盒(Dye-primer或Dye-ter-minator),其中每種試劑的濃度為產品的最佳組合,而且測序反應的條件(變性、退火、延伸的時間和溫度)與試劑盒配套使用。這就必須按照試劑盒的要求控制好模板的濃度,即使純度合格的DNA模板其濃度也很重要,單鏈DNA模板為0.10g/L,雙鏈質粒模板為0.20g/L,PCR產物根據其片段的長度取適當的量,濃度過高或過低都會直接影響測序的結果。根據我們的使用情況,濃度太高時,電泳條帶信號強,會出現平頭峰,測序結果短(一般<250bp),而且誤差大;濃度過低時,電泳條帶信號弱,噪聲多,誤差大,可信度差。在使用Dye-termina-tor法測序時(一般模板為PCR產物),除模板的純度和濃度符合要求外,所用引物的純度和濃度也很重要,引物應為測序級純度,濃度應準確定量。

2.3 電泳條件是保證 前面已提到,測序反應產物經電泳分離后,實時進行自動讀序,要使只差1個堿基的DNA鏈達到最佳分離,電泳的條件至關重要。373A型DNA測序儀使用的是尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,凝膠濃度為4.75%,恒功率(30W),這些條件相對固定,所以電泳的成敗主要取決于凝膠的配制。一是電泳試劑的純度。由于該系統是檢測熒光信號,所以要求試劑不能含有雜質,我們使用Sigma公司的試劑和部分國產分析純試劑,經實驗證實可以達到實驗的要求。二是凝膠配制。要求各種試劑的稱量要準確,除凝膠濃度準確外,TBE緩沖液的配制尤為重要,否則會影響電泳結果,造成測序失敗,這是由于TBE的離子濃度的高低可直接引起電泳時電壓的升高或降低。三是灌膠要仔細。要防止產生氣泡、波浪紋等而影響電泳分離。

總之,在使用全自動DNA測序儀時,模板的純度和濃度、測序反應、電泳分離等環節都會影響測序的結果,任何一個環節出現問題,都會造成前功盡棄。根據我們的經驗,在測序試劑盒質量有保證、儀器工作正常、實驗人員精心操作的前提下,測序模板的純度和濃度是測序成功的關鍵,測序失敗往往是由于模板的純度不夠或濃度不準所致。兩年來中我們測定了數百份樣品,成功率達到88%。其中Dye-primer法測定的樣品占95%,單鏈DNA模板單向測序可達700bp~800bp,雙鏈質粒模板單向測序可達500bp~600bp。
 

編輯:songjiajie2010

 
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