數(shù)字PCR無(wú)疑是PCR領(lǐng)域最激動(dòng)人心的創(chuàng)新之一，這一技術(shù)的誕生讓許多人定量的夢(mèng)想成為現(xiàn)實(shí)。定量PCR和數(shù)字PCR都能實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行定量，它們之間的差別在于定量PCR依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照基因，而數(shù)字PCR則能計(jì)數(shù)DNA分子進(jìn)行定量。在許多領(lǐng)域的研究中數(shù)字PCR都是難以取代的寶貴技術(shù)，包括檢測(cè)罕見(jiàn)等位基因、在野生型背景下鑒定突變基因、區(qū)別低水平的拷貝數(shù)變異、驗(yàn)證二代測(cè)序結(jié)果和基因表達(dá)分析等。
   數(shù)字PCR的基本工作原理很簡(jiǎn)單，先將樣品劃分為多個(gè)PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)最多只含有一個(gè)目標(biāo)分子，然后用熒光標(biāo)記的探針進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)數(shù)含有目標(biāo)分子的反應(yīng)。正因如此，數(shù)字PCR不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以真正實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定量。不過(guò)，這并不意味著dPCR就永遠(yuǎn)是的選擇。“盡管數(shù)字PCR能夠定量，其工作流程也比傳統(tǒng)qPCR簡(jiǎn)單得多，但數(shù)字PCR的通量比較低，”Fluidigm公司的分子生物學(xué)主管Ramesh Ramakrishnan說(shuō)。“總的來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)qPCR通量更高，而數(shù)字PCR的靈敏度和性更好。在尋找罕見(jiàn)突變時(shí)數(shù)字PCR尤其適用。”
二、分液帶來(lái)的高精度

樣品分液（Partitioning）是決定數(shù)字PCR性的最重要因素之一。數(shù)字PCR通過(guò)分液將樣品分成小份，通常每一份最多只含有一個(gè)拷貝的目標(biāo)核酸。熒光標(biāo)記的探針可以用來(lái)揭示目標(biāo)核酸存在與否，并由此獲得初始樣品中的分子數(shù)。“數(shù)字PCR這種方法非常簡(jiǎn)單，一個(gè)陽(yáng)性信號(hào)代表著一個(gè)目標(biāo)分子，而沒(méi)有信號(hào)就意味著目標(biāo)不存在。”Ramakrishnan說(shuō)。

Life Technologies公司的TaqMan® OpenArray® 數(shù)字PCR試劑盒可以在OpenArray® 平板上運(yùn)行，OpenArray® 平板是一種不銹鋼的微流體平板，只有顯微鏡載玻片大小。這種平板的表面刻有3,072個(gè)通孔，每一個(gè)通孔都是一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)孔。每塊平板上的通孔排列形成48個(gè)子陣列，每個(gè)子陣列含64個(gè)通孔。OpenArray® 平板的外表面由疏水包被，而通孔內(nèi)部是親水包被，由此分隔各通孔中的樣品，使其無(wú)法彼此接觸和混合。

OpenArray® 平板可以在Life Technologies的OpenArray® 實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)和QuantStudio™ 12K Flex 上使用。QuantStudio™ 12K Flex dPCR儀能支持96孔或384孔板、TaqMan® Array卡片和中等密度的OpenArray平板。“QuantStudio™ 12K Flex dPCR儀能夠同時(shí)運(yùn)行四個(gè)OpenArray平板，一次性生成12,228個(gè)單獨(dú)的PCR循環(huán)，并且實(shí)時(shí)收集PCR擴(kuò)增的數(shù)據(jù)，”Life Technologies公司的qPCR資深產(chǎn)品Iain Russell說(shuō)。“OpenArray數(shù)字PCR平板的開(kāi)放性，使研究者們可以根據(jù)自身需要，對(duì)反應(yīng)的重復(fù)數(shù)進(jìn)行調(diào)整，在通量、性能和實(shí)驗(yàn)成本之間達(dá)到平衡。你可以每種樣品只使用一個(gè)子陣列，這樣運(yùn)行一次就可以得到192個(gè)數(shù)字PCR結(jié)論。或者你也可以一種樣品運(yùn)行四個(gè)平板（192個(gè)子陣列），使系統(tǒng)性能和可重復(fù)性最大化。”

Fluidigm和Life Technologies采用微流體芯片和微流體通道進(jìn)行數(shù)字PCR。與此不同的是，Bio-Rad選擇將樣品分為微小的液滴，RainDance Technologies隨后也加入了這一行列。“我們的*優(yōu)勢(shì)在于，可以將樣品分為1納升液滴，這些液滴的一致性和可重復(fù)性都非常好。通過(guò)這一技術(shù)，我們可以將每個(gè)樣品分為20,000個(gè)液滴，” Kurtz說(shuō)。其他系統(tǒng)的分液數(shù)量大多在760到3,000之間，“分液數(shù)量越多可以使分析更為。”由于分液更多，在Bio-Rad的系統(tǒng)中每個(gè)液滴能容納多至五個(gè)目標(biāo)，大大提高了檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍。“我們的系統(tǒng)可以解析1至100,000個(gè)目標(biāo)拷貝，因此不需要在運(yùn)行數(shù)字PCR之前對(duì)樣品進(jìn)行系列稀釋?zhuān)�”Kurtz補(bǔ)充道。