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聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE膠的制備過程

放大字體  縮小字體 發布日期:2024-02-28  來源:上海源葉生物科技有限公司
核心提示:聚丙烯酰胺凝膠電泳 可用于蛋白和寡核苷酸的分離,最常用于蛋白質的分離,這里總結了DNA電泳的各種濃度PAGE膠配制的配方及制

聚丙烯酰胺凝膠電泳 可用于蛋白和寡核苷酸的分離,最常用于蛋白質的分離,這里總結了DNA電泳的各種濃度PAGE膠配制的配方及制備方法。

聚丙烯酰胺 凝膠電泳簡稱為PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成,這一聚合過程需要有自由基催化完成。

各種濃度PAGE膠的配制(DNA電泳用)

50ml體系:

丙烯酰胺

有效分離(bp)

二甲苯青

溴酚藍

丙烯酰胺30%(ml)

10×TBE(ml)

ddH2O(ml)

TEMED(µl)

過硫酸銨10%(µl)

3.5%

100-1000

460

100

5.83

5

39.17

25.0

250

5.0%

100-500

260

65

8.33

5

36.67

25.0

250

8.0%

60-400

160

45

13.33

5

31.67

25.0

250

12.0%

40-200

70

20

20.0

5

25.00

25.0

250

15.0%

25-150

60

15

25.0

5

20.00

25.0

250

20.0%

5-100

45

12

33.33

5

11.67

25.0

250

5ml體系:

丙烯酰胺

丙烯酰胺30%
(ml)

10×TBE
(ml)

ddH2O
(µl)

TEMED
(µl)

過硫酸銨10%
(µl)

3.5%

0.583

0.5

3.917

2.5

25

5.0%

0.833

0.5

3.667

2.5

25

8.0%

1.333

0.5

3.167

2.5

25

12.0%

2.00

0.5

2.5

2.5

25

15.0%

2.50

0.5

2.0

2.5

25

20.0%

3.333

0.5

1.167

2.5

25

1、丙烯酰胺30%為29:1(質量比,丙烯酰胺:雙甲叉丙烯酰胺)

2、TEMED 可以加到1ul/ml。

不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍表

丙烯酰胺(%)

有效分離范圍(bp)

溴酚蘭*

二甲苯青*

3.5

100~2000

100

460

5.0

80~500

65

260

8.0

60~400

45

160

12.0

40~200

30

70

15.0

25~150

15

60

20.0

10~100

12

45

*表中給出的數字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子 所含堿基對數目(bp).

凝膠的制備過程:

1、 按要求裝配好垂直電泳板,兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊,防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出。

2、 將裝好的玻璃電泳板傾斜成45~60°。

3、 按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數。

4、 加入TEMED后,立即混勻,緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中,直到液體接近溢出時為止。

5、 立即插入適當的梳子,密切注意防止梳齒下產生氣泡,用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上,然后將玻璃板斜靠在物體上,使成10°角,可減少液體泄漏的機會。

6、 室溫聚合一小時后,將玻璃板插入電泳槽中,上緊,倒入0.1XTBE緩沖液。

7、 小心取出梳子,加樣。

大家可以根據自己試驗中DNA片段大小的不同選擇配制合適濃度的丙烯酰胺膠。PAGE膠配制過程中記得避免氣泡的產生。

 

編輯:songjiajie2010

 
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