凡是需要做分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的lab，肯定逃不了要買(mǎi)一臺(tái)核酸定量的機(jī)器。目前最為流行的儀器是Nanodrop，只需滴加一兩微升的樣品，按一下按鈕，利用核酸的紫外吸收特性，即可得到濃度數(shù)據(jù)。近幾年，以Qubit為代表的基于特異熒光染料法的儀器也逐漸進(jìn)入科研人員的視野。那么，這兩類儀器有什么區(qū)別，在使用時(shí)需要注意什么，如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)室需求來(lái)選購(gòu)?如下文所示。

首先我們需要來(lái)理解兩臺(tái)儀器在核酸定量原理上的區(qū)別。正如方才所言，Nanodrop利用了核酸的紫外吸收特性。

Nanodrop

檢測(cè)方法原理為核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵系統(tǒng)，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波長(zhǎng)處。一般在260nm波長(zhǎng)下，每1ml含1μg RNA溶液的光吸收值為0.022~0.024，每1ml含1μg DNA溶液的光吸收值約為0.020，故測(cè)定未知濃度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可計(jì)算出其中核酸的含量。此法操作簡(jiǎn)便，迅速。若樣品內(nèi)混雜有大量的核苷酸或蛋白質(zhì)等能吸收紫外光的物質(zhì)，則測(cè)光誤差較大，故應(yīng)設(shè)法事先除去。NanoDrop及其它紫外分光光度計(jì)均采用紫外吸光度進(jìn)行檢測(cè)，它無(wú)法區(qū)分出DNA、RNA、降解核酸、游離核苷酸及其它雜質(zhì)。盡管紫外吸收定量法是最常用的一種DNA或RNA定量方法，但其讀數(shù)并不可靠，不能用于后續(xù)建庫(kù)的參考。

Qubit

Qubit熒光計(jì)是新一代核酸和蛋白定量?jī)x，實(shí)驗(yàn)臺(tái)上可以對(duì)DNA和RNA進(jìn)行精準(zhǔn)定量，它可以采用熒光染料檢測(cè)特定目標(biāo)分子的濃度。它采用的是熒光檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)采用與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光的Molecular Probes® 染料。這些熒光染料可以特異地與不同種類的核酸鏈相結(jié)合，并在特定波長(zhǎng)光源的激發(fā)下，發(fā)出熒光。其中，結(jié)合了核酸的熒光染料，相比那些游離的，信號(hào)可增幅數(shù)十倍至數(shù)百倍，因此可以和背景區(qū)分開(kāi)來(lái)。目前，做測(cè)序的實(shí)驗(yàn)室基本把Qubit當(dāng)標(biāo)配儀器了。

雖然以Nanodrop為代表的紫外吸收法在科研領(lǐng)域已經(jīng)沿用了數(shù)十年，但由于原理上的限制，這一類儀器有無(wú)法避免的缺陷。

1、紫外吸收法無(wú)法區(qū)分DNA和RNA

這一點(diǎn)其實(shí)在原理上就很好理解了。如下圖所示，具有紫外吸收的結(jié)構(gòu)是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基，因此當(dāng)一份樣品同時(shí)含有DNA和RNA的時(shí)候，無(wú)論你本意是想測(cè)哪一個(gè)，均會(huì)高估其真實(shí)濃度。

而Qubit的熒光染料法則避免了這個(gè)問(wèn)題。只要采用DNA、RNA特異的染料，就能有選擇性地測(cè)定樣品中的核酸濃度。下圖是Qubit的官方測(cè)試數(shù)據(jù)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是在DNA樣品中混合入不同比例的RNA，并用Qubit法和紫外吸收法分別進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)DNA的樣品足夠純時(shí)(DNA：RNA = 10：0)，兩種方法測(cè)得的數(shù)值并沒(méi)有顯著區(qū)別。但當(dāng)混入的RNA越來(lái)越多，紫外吸收的數(shù)值也跟著升高(藍(lán)色和綠色柱子)，而使用雙鏈DNA染料的Qubit數(shù)值則沒(méi)有改變(紅色柱子)。使用RNA染料用Qubit進(jìn)行測(cè)定，則會(huì)發(fā)現(xiàn)，隨著RNA混入的增加，讀數(shù)也跟著升高。

目前，雙鏈和單鏈DNA、RNA及蛋白質(zhì)均有特異的熒光染料。也就是說(shuō)，無(wú)需專門(mén)純化樣品，或者在未知污染程度的情況下，使用Qubit可以方便地得知濃度信息。

2、紫外吸收法的定量限較高

對(duì)于任何儀器分析，都具備其檢出限和定量限。Nanodrop標(biāo)稱的檢出限是2ng/µl(雙鏈DNA)，然而定量限則遠(yuǎn)高于此。其他的Nanodrop用戶也有類似的體驗(yàn)，曾經(jīng)在ResearchGate上看到說(shuō)，低于50ng/µl的話就容易測(cè)不準(zhǔn)，變異度會(huì)增大。以下同樣是來(lái)自Qubit的官方數(shù)據(jù)。當(dāng)DNA的濃度低于某個(gè)程度時(shí)，紫外吸收法的偏差和變異度就突破天際了。

Qubit與紫外吸收法測(cè)定低濃度DNA時(shí)的偏差及變異度比較

這兩張圖中，紫外吸收法得到的偏差和變異度在我看來(lái)已經(jīng)算小的了，要低于4 ng/µl雙鏈DNA才會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。然而在實(shí)際使用中，低于10甚至20 ng/µl時(shí)就比較容易出亂子。而PCR產(chǎn)物膠回收等應(yīng)用，最終的實(shí)際濃度往往就落在這個(gè)容易測(cè)不準(zhǔn)的范圍內(nèi)。

3、紫外吸收法對(duì)溶液的pH和鹽濃度敏感 

在研究物質(zhì)吸光度時(shí)，我們總要明確地定義緩沖液的離子強(qiáng)度以及pH，這就說(shuō)明，吸光度本身是受到這兩個(gè)因素影響的。

通常而言，偏酸的溶液，容易給出偏低的A260/A280數(shù)值。相反，偏堿的溶液則容易高估。相應(yīng)地，也有報(bào)道稱，當(dāng)用水作為溶劑時(shí)，紫外吸收測(cè)定的數(shù)值變異度增大，而當(dāng)使用Tris或Tris-EDTA溶液進(jìn)行測(cè)定時(shí)，重復(fù)性就提高了。這其中的原因，很可能是空氣中溶解入水中的CO₂濃度差異造成的。離子強(qiáng)度對(duì)于紫外吸收的影響比較復(fù)雜，這里不展開(kāi)。

相比之下，熒光染料法對(duì)樣品的污染和pH等的容忍度較大。

4、紫外吸收法對(duì)降解比較嚴(yán)重的核酸無(wú)能為力 

這一點(diǎn)，同樣也是由紫外吸收原理的局限性所決定的。紫外吸收測(cè)定的對(duì)象是堿基，因此無(wú)論核酸是完整成鏈的，還是降解成單個(gè)游離核苷酸，該方法均無(wú)法加以區(qū)分。盡管我們可以通過(guò)A260/A280數(shù)值是否過(guò)大來(lái)估計(jì)核酸樣品的降解狀況，但卻無(wú)法選擇性地只測(cè)定那些結(jié)構(gòu)完整的核酸的濃度。

而熒光染料通常結(jié)合的是核酸的鏈結(jié)構(gòu)，并不會(huì)與游離的單核苷酸相互作用。不過(guò)話說(shuō)回來(lái)，對(duì)于那些尚未降解成單個(gè)核苷酸而呈短鏈狀態(tài)的核酸，熒光染料法是無(wú)法將其與完整核酸區(qū)分開(kāi)來(lái)的。

結(jié)語(yǔ)

如果在實(shí)驗(yàn)中獲得的核酸樣品總是很純凈且均一(如原材料是容易對(duì)付的培養(yǎng)細(xì)胞，還用品質(zhì)好的試劑盒進(jìn)行抽提；而非奇奇怪怪的極端樣品，還要是自己配的試劑)，同時(shí)產(chǎn)量又很高，那紫外吸收法完全可以勝任，外加測(cè)定速度秒殺熒光染料法。此外，熒光染料法對(duì)溫度比較敏感，比如上一回是在25℃室溫制作并儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)曲線，而這一回要測(cè)定樣品時(shí)實(shí)驗(yàn)室空調(diào)壞掉，一下子有了3℃以上的溫差，那么標(biāo)曲就得重新制作。同時(shí)，熒光染料要現(xiàn)用現(xiàn)配，樣品至少要染2min，花費(fèi)的時(shí)間比紫外吸收法要長(zhǎng)。