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PCR反應問題解答(一)無擴增條帶

放大字體  縮小字體 發布日期:2024-07-24  來源:上海撫生實業有限公司
核心提示:聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便

聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點。

PCR反應過程常出現各種問題,下面對問題做詳細匯總解答:

1. 無擴增條帶

(1)酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活,往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。

(2)模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。

(3)變性溫度是否準確:PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符,過高酶在前幾個循環就迅速失活;過低則模板變性不全。

(4)反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶,應在未加Taq酶以前,將反應體系95℃加熱5-10分鐘。

(5)引物變質失效。人工合成的引物是否正確。是否純化,或因儲存條件不當而失活。

(6)引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

(7)DNA凝膠電泳時加入陽性對照,確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。

編輯:songjiajie2010

 
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