當(dāng)僅有小量RNA時(shí)，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量。可以在加入Trizol的同時(shí)加入無RNase的糖元。對于小于50mg的組織106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入乙酰化BSA可以增加靈敏度，而且對于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加40單位的RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)加入BSA或RNase抑制劑。

7、減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個(gè)潛在的困難是RNA中有基因組DNA污染，可以在逆轉(zhuǎn)錄之使用擴(kuò)增的DNaseⅠ對RNA進(jìn)行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時(shí)所發(fā)生的依賴于鎂離子的DNA水解。為了將擴(kuò)增的cDNA同沾染的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物分開，可以設(shè)計(jì)分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會(huì)比來源于污染的基因組DNA的產(chǎn)物短。另外對每個(gè)RNA模板進(jìn)行一個(gè)無逆轉(zhuǎn)錄的對照實(shí)驗(yàn)，以確定一個(gè)給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉(zhuǎn)錄時(shí)所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。