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ELISA實驗操作質控全方面探討(一)

放大字體  縮小字體 發布日期:2024-10-16  來源:上海撫生實業有限公司 
核心提示:在ELISA的研發制備中尤為重要的就是它的指控流程,包括抗原設計及制備篩選,抗體制備,標準品的定量,檢測液的優化,試劑盒的組裝


在ELISA的研發制備中尤為重要的就是它的指控流程,包括抗原設計及制備篩選,抗體制備,標準品的定量,檢測液的優化,試劑盒的組裝,以及各種性能的驗證。對于科研工作者來說,要制備一個好的ELISA kit,需要具備敏感性高,特異性強,重復性好,并且其試劑穩定、易保存,操作簡便等。下面來看一下ELISA的質控控制。

1. 抗原抗體選擇

ELISA檢測原理基于抗原抗體反應,其質量影響了試劑盒的性能。對于大分子蛋白抗原,多采用雙抗體夾心法,使用優的抗體對,且至少有一種為單抗,配對篩選最佳信噪比的包被和檢測抗體。對于抗原為多肽和小分子(或者偶聯物),多采用競爭抑制法,抗體的是經過驗證的單克隆抗體或者多克隆抗體。

2. 標準品

對于標準品定量的準確性,每個公司對于定量標準和方法可能會有不同,這是企業標準。試劑盒使用的標準品多為重組蛋白或者單價的小分子, 定量可參考國際標準品,國家標準物質信息網或者一些大公司,如R&D, Abcam等。標準品的定量直接會決定試劑盒最后樣本的檢測結果。

3. 天然樣本驗證分析

我們在選擇樣本時,避免使用有外源性污染的樣本,避免血樣本出現溶血、細菌污染,最好使用較新鮮樣本,避免反復凍融。
血清是最為常見的檢測樣本,但是大約40%的血清標本中含有非特異性干擾物質,可以不同程度影響檢測結果;常見的干擾物質有:類風濕因子RF、補體、交叉反應物質和異嗜性抗體等其他物質等。避免其發生的方法有:

①標本用聯有熱變性IgG的固相吸附劑處理。

②用2-C2H6OS加入到標本稀釋液中使RF降解。

③56℃ 30 min加熱血清使補體滅活。

在樣本檢測中,稀釋對于實驗的成功也至關重要,稀釋過度以及稀釋不足均有可能導致樣本的測值低。Elisa 實驗較為常見的一個現象就是鉤狀效應,即抗原與抗體比例不合適而導致假陰性的現象,抗原過量稱為后帶效應。當樣本中目標物含量很高,而沒有進行正確的稀釋,就有可能會導致假陰性反應。

編輯:songjiajie2010

 
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