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常見測(cè)蛋白濃度方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較(一)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-11-04  來(lái)源:上海炎熙生物科技有限公司
核心提示:蛋白濃度測(cè)定的方法有很多,但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性,因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒ǎ詽M足

蛋白濃度測(cè)定的方法有很多,但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性,因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒ǎ詽M足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果精確,但操作復(fù)雜,用于大批量樣品的測(cè)試則不太合適;Lowry法精確度較高,但是比較費(fèi)時(shí),且每步的時(shí)間要求相對(duì)嚴(yán)格;Bradford法靈敏簡(jiǎn)便,但易受去垢劑的影響;BCA法以其試劑穩(wěn)定,抗干擾能力強(qiáng),結(jié)果穩(wěn)定,靈敏度高而受歡迎。

1. Bradford法:

原理:在酸性環(huán)境中,蛋白質(zhì)結(jié)合考馬斯亮藍(lán)G250染料,導(dǎo)致染料的吸收峰發(fā)生位移,從紅棕色形式(吸收峰 465nm)轉(zhuǎn)化為藍(lán)色形式(吸收峰 610nm)。這兩種形式在 595nm 處光吸收差異most大,因此 595nm 是測(cè)定考馬斯染料-蛋白復(fù)合物的藍(lán)色的best波長(zhǎng)。結(jié)合到每個(gè)蛋白質(zhì)分子上的考馬斯染料分子數(shù)大致與蛋白所帶正電荷的數(shù)量成正比,因此通過(guò)比色法可以測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量。

優(yōu)點(diǎn):

1. 靈敏度高,可以檢測(cè)到1μg/ml的蛋白質(zhì)濃度。

2. 反應(yīng)時(shí)間短,反應(yīng)時(shí)間只需5-10分鐘。

3. 操作簡(jiǎn)單,只需加入試劑,混合均勻即可。

4. 適用范圍廣,適用于大部分類型的蛋白質(zhì)。

5. 不受溶液中還原劑的影響。

缺點(diǎn):

1. 受干擾:某些離子和化合物會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果,去垢劑(表面活性劑)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈干擾,使得與許多常用的緩沖液不兼容。

2. 靈敏度不穩(wěn)定:不同蛋白質(zhì)的靈敏度不同,有些蛋白質(zhì)可能無(wú)法被檢測(cè)到。肽或蛋白質(zhì)的分子量必須大于 3,000 道爾頓才能被檢出。

3. 需要標(biāo)準(zhǔn)曲線:需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)濃度,增加了操作步驟。

近來(lái)市場(chǎng)上已出現(xiàn)能兼容去垢劑的Bradford法蛋白定量試劑盒,可以兼容各種常用的蛋白緩沖液,大大拓展了應(yīng)用范圍。

編輯:songjiajie2010

 
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