在线观看亚洲精品专区-在线观看亚洲免费-在线观看亚洲免费视频-在线观看亚洲欧美-欧美freexxx-欧美free嫩交video

食品伙伴網服務號
當前位置: 首頁 » 儀器設備 » 分子生物學儀器 » 正文

PCR反應條件如何優化

放大字體  縮小字體 發布日期:2025-02-18  來源:網絡
核心提示: PCR反應條件:變性、退火 、延伸、循環次數,PCR反應條件提升分析:1.變性:在第一輪循環前,在94℃下變性5~10min 非常重要
 PCR反應條件:變性、退火 、延伸、循環次數,PCR反應條件提升分析:

1.變性:在第一輪循環前,在94℃下變性5~10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全,往往使PCR 失敗,因為未變性完全的DNA 雙鏈會很快復性,減少DNA 產量。一般變性溫度與時間為94℃ 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時間主要是為使反應體系完全達到適當的溫度。對于富含GC 的序列,可適當提高變性溫度,但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。

2.退火:這是PCR 的一個關鍵參數。在理想狀態下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm 低5℃, 當產物中包含有影響實驗的非可異性擴增帶時,以2℃為增量,逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。如果兩個引物Tm 不同,將退火溫度設定為比最低的Tm 低5℃。或者為了提高特異性,可以在根據較高Tm 設計的退火溫度先進行5 個循環,然后在根據較低Tm 設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高,所得產物的特異性越高。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個擴增循環,既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數秒鐘即可完成,反應中所需時間主要是為使整個反應體系達到合適的溫度。

3.延伸:延伸反應通常為72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最適反應溫度75℃。實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為Taq DNA 聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃。延伸反應時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。在一般反應體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb 長的DNA。延伸時間過長會導致產物非特異性增加。但對很低濃度的目的序列,則可適當增加延伸反應的時間。一般在擴增反應完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應,以獲得盡可能完整的產物,這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。

4.循環次數: 當其它參數確定之后,循環次數主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30輪循環已經足夠。循環次數過多,會使PCR 產物中非特異性產物大量增加。通常經25-30 輪循環擴增后,反應中Taq DNA 聚合酶已經不足,如果此時產物量仍不夠,需要進一步擴增,可將擴增的DNA 樣品稀釋103-105倍作為模板,重新加入各種反應底物進行擴增,這樣經60 輪循環后,擴增水平可達109-1010。擴增產物的量還與擴增效率有關,擴增產物的量可用下列公式表示:C=C0(1+P)n 。其中:C 為擴增產物量,C0 為起始DNA 量,P 為增效率,n 為循環次數。在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應,減少非特異性產物。

編輯:songjiajie2010

 
分享:
[ 網刊訂閱 ]  [ 儀器設備搜索 ]  [ ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 關閉窗口 ] [ 返回頂部 ]
 

 
 
推薦圖文
推薦儀器設備
點擊排行
 
 
Processed in 0.138 second(s), 18 queries, Memory 0.9 M
主站蜘蛛池模板: 深夜视频免费在线观看 | 久操视频免费观看 | 婷婷综合激六月情网 | 午夜在线看片 | 污视频18高清在线观看 | 免费国产99久久久香蕉 | 手机看片日韩永久福利盒子 | 久久夜色精品国产亚洲噜噜 | 婷婷色在线观看 | 久久免费精品高清麻豆 | 精品国产免费人成高清 | 天天做天天爱天天影视综合 | 日本最黄视频 | 你懂得国产| 羞涩妩媚玉腿呻吟嗯啊销魂迎合 | 美女被羞羞产奶视频网站 | 操美女免费视频 | 天天爽夜夜爽免费看 | 手机在线一区二区三区 | 国产理论最新国产精品视频 | 米奇777四色精品人人爽 | 国内自拍露脸普通话对白在线 | 免费的两性视频网站 | 在线黄色免费网站 | 日本精品卡一卡2卡3卡四卡三卡 | 一级特黄a视频 | 性欧美日韩| 亚色在线观看 | 在线观看www日本免费网站 | 一级一片一a一片 | 免费高清在线视频色yeye | 色妞综合| 午夜免费啪视频观看网站 | 五月天丁香婷 | 天堂中文在线资源库用 | 免费二级c片观看 | 国产成人精品1024在线 | 一级一黄在线观看视频免费 | 天堂色网 | 你懂的免费在线观看 | 韩国理伦片在线观看2828 |