|
| 
| 產(chǎn)品索引 | 5870 |
| 中文名稱： | plasmid DNA的抽提•純化試劑盒 |
| 英文名稱： | MagExtractor®-Plasmid- |
| 產(chǎn)品編號： | NPK - 300 |
|
產(chǎn)品類別： |
分子生物學(xué) |
| 生產(chǎn)廠家： | TOYOBO |
| 產(chǎn)品價格： | 300 |
| 產(chǎn)品規(guī)格： | 50次 |
Nucleic Acid Purification Kit
MagExtractor
-Plasmid-
使用說明書
(Code No. : NPK - 301)
TOYOBO CO. , LTD. Biochemical Operation Department
OSAKA JAPAN
—目錄—
[1] 前言............................................................................................................................. 1
[2] 使用前須知................................................................................................................. 1
[3] 試劑盒中所包含的物品............................................................................................. 2
[4] 操作程序..................................................................................................................... 2
1．試劑盒以外所需要的其他物品.......................................................................... 2
（1）試劑............................................................................................................. 2
（2）器具·器材................................................................................................. 2
2．抽提流程.............................................................................................................. 3
3．宿主菌的培養(yǎng)...................................................................................................... 3
4．集菌...................................................................................................................... 4
5．試劑的制備.......................................................................................................... 5
6．用MFX-2000抽提DNA的方法....................................................................... 5
（1）操作程序的選擇......................................................................................... 5
（2）加溫block，回收block的溫度設(shè)定....................................................... 6
（3）附帶專用過濾器的tip頭設(shè)置................................................................... 6
（4）專用試管的設(shè)置......................................................................................... 7
（5）試劑的設(shè)置................................................................................................. 8
（6）樣品的前處理及其設(shè)置........................................................................... 10
（7）抽提開始................................................................................................... 11
（8）樣品的回收............................................................................................... 11
（9）根據(jù)操作手冊抽提plasmid DNA的方法............................................ 12
[5] 一般樣品的分析....................................................................................................... 13
（1）A260，A280及A320的測定......................................................................... 13
（2）電泳........................................................................................................... 13
（3）DNA測序................................................................................................. 13
[6] 疑難解答................................................................................................................... 14
1．使用MFX-2000的場合................................................................................... 14
2．手動操作的場合............................................................................................... 14
注意：
本試劑盒中所包含的試劑都是研究用試劑。請不要用于診斷，臨床等場合。在使用本試劑盒的時候，請嚴格遵守實驗室的基本注意事項，并注意安全。
[1] 前言
MagExtractor -Plasmid-利用在Chaotrpic（鹽）試劑存在的情況下，核酸能吸附在硅膠表面的特性，進行plasmid DNA的抽提·純化。磁性體使用的是封入的磁珠，所以能夠利用永久磁石很容易地分離回收核酸。磁珠依據(jù)吸附條件，分別對蛋白質(zhì)，DNA，RNA等不同物質(zhì)具有不同的吸附能力，所以能夠簡便地純化核酸。本試劑盒除了作為用于全自動核酸抽提裝置MFX-2000的試劑外，也可以作為手動抽提試劑盒來使用。
性能·特征
·能夠從大腸菌中抽提·純化出plasmid DNA
·能夠回收3～6μg的plasmid DNA（50～150ng/μl）*1，可用于轉(zhuǎn)化，限制酶處理，DNA 測序反應(yīng)等。
·能在10～15min之內(nèi)抽提出plasmid DNA。
·不使用苯酚、氯仿等危險溶液。
·無需乙醇沉淀。
[2] 使用前須知
1）注意
MagExtractor -Plasmid-準(zhǔn)備了四種對應(yīng)于MFX-2000，二種對應(yīng)于手動的操作程序。使用對磁珠不進行干燥處理的操作程序（手動操作程序Ⅰ以及MFX-2000的”Speedy”和”Lowcost”等操作程序）所得到的回收液，需要注意以下幾點。
·對于限制酶及轉(zhuǎn)化處理，可直接加以使用。
·瓊脂糖電泳時的Loading Dye必須使用本試劑盒附帶的產(chǎn)品。使
用一般的產(chǎn)品組分時，可能樣品會無法沉淀。
·當(dāng)用于DNA測序時的模板時，乙醇會阻礙測序反應(yīng)，可將回收液置于1.5ml試管內(nèi)，保持試管打開狀態(tài)加溫至78℃ 40min。（也可只加溫處理必要的劑量。參考13頁。）
·為了不讓乙醇混入回收液中，請使用手動操作程序Ⅱ（參
考12～13頁），如果是MFX-2000的場合下，請使用”Dryup”
或”Fullauto”等操作程序。
*1 從M109/pUC19過夜培養(yǎng)液中進行抽提的場合。
[3] 試劑盒中所包含的物品
本試劑盒中含有能夠進行500次plasmid DNA回收的試劑量。
130 x 2ml........ 吸附液（含有蛋白質(zhì)變性劑）............................................ 4℃或者室溫下保存
16ml........ 磁珠Ⅰ............................................................................. 4℃或者室溫下保存
16ml........ 磁珠Ⅱ............................................................................. 4℃或者室溫下保存
80ml........ 再懸浮液....................................................................................... 4℃下保存
80ml........ 溶解液Ⅰ（含有蛋白質(zhì)變性劑）........................................ 4℃或者室溫下保存
20ml........ 溶解液Ⅱ（含有蛋白質(zhì)變性劑）...................................................... 4℃下保存
65ml........ 中和液............................................................................. 4℃或者室溫下保存
60ml........ 溶出液.......................................................................................... 4℃下保存
11ml........ 5 x Loading Dye........................................................................... 4℃下保存
·試劑如果沾在手或衣服上或使用后，請徹底用清水清洗。萬一不慎進入眼睛，立刻
用清水徹底清洗，然后去看醫(yī)生。
·溶解液Ⅰ有時會產(chǎn)生析出物。請在室溫～40℃下完全溶解后再使用。
·溶解液Ⅰ，Ⅱ的混合液在室溫下保存超過三個星期后請不要再使用。*1溶解液Ⅰ，Ⅱ以外的試
劑請在4℃下保存。
·使用本公司的核酸自動抽提裝置MFX-2000的情況下，請在指定的瓶中注入必要的劑量，置于指定部位。詳細方法請參考MFX-2000的使用說明書。
[4] 操作程序
1．試劑盒以外所需要的其他物品
（1）試劑
·滅菌水（蒸餾水或者milliQ水經(jīng)過高溫高壓濕熱滅菌）
·乙醇溶液（99.5％以上的特級品，使用手動法的時候用70％
的乙醇溶液）
（2）器具·器材
·微量移液器
·微量移液器用的tip頭
使用MFX-2000的場合，必須配備以下物品。
·抽提專用試管（Code No：MFX-301）
·抽提專用6連試管（Code No：MFX-302）
·附帶專用過濾器的tip頭（Code No：MFX-402）
*1 有時plasmid DNA的回收量及純度會發(fā)生降低。
·試劑設(shè)置用試管（50ml用，15ml用，2ml用*1）
使用手動法的場合，必須配備以下物品
·1.5ml小型試管用的磁性臺架（商店有售）
·漩渦混合器或者小型試管混合器
·簡易臺式離心機（12,000r.p.m.）
2．抽提流程
MagExtractor -Plasmid-通過以下五個工序?qū)lasmid DNA進行抽提和純化。
①集菌
②堿溶菌
③中和
④通過磁珠Ⅰ去除菌體殘渣
⑤通過磁珠Ⅱ分解，純化Plasmid DNA
使用MagExtractor -Plasmid-和MFX-2000時，上述的②～⑤可成為自動化操作。
3．宿主菌的培養(yǎng)
培養(yǎng)含Plasmid DNA的大腸桿菌。培養(yǎng)基可使用和通過LB，TB等堿性SDS法等方法來抽提Plasmid DNA的時候同樣的培養(yǎng)基。由于Plasmid的回收量受拷貝數(shù)量以及菌體數(shù)量影響，推薦使用使MagExtractor -Plasmid-能夠使回收量更加穩(wěn)定的MMI培養(yǎng)基。使用MMI培養(yǎng)基的情況下，菌體量和TB的情況等同（JM109 / pUC18，50μg / ml氨芐青霉素9～11O.D.）。
MMI培養(yǎng)基的配制方法
|←蒸餾水800ml
|←13g Bacto trypton
|←25g Bacto yeast extract
|←8.5g NaCl
|←4ml 丙三醇
|←20ml 1M Tris-HCI，pH7.2
| 加蒸餾水到1000ml
| 高溫高壓濕熱滅菌
*1 50ml，15ml試管請使用BECTON DICKINSON公司生產(chǎn)的BLUE MAX
2170,BLUE MAX 2196,2m試管請使用本公司生產(chǎn)的NO.72.693。
4．集菌
使用MagExtractor -Plasmid-能夠處理的菌體量在手動法時是12～13O.D.，使用MFX-2000時是5～9 O.D.。根據(jù)菌體量和抽提方法的不同所引起的回收量的不同可以參考下圖所示。在使用MFX-2000處理10 O.D.以上的劑量時，有可能會無法進行充分的攪拌（pipetting），使得純度下降，請務(wù)必注意。使用angle rotor對1.5ml試管進行集菌時，菌體量請按照圖2所示為標(biāo)準(zhǔn)。
·請將培養(yǎng)液置于1.5ml試管中。
·請用12,000rpm離心分離2min。
·請仔細去除上清部分。
手動法
MFX-2000
菌體量（O.D.）
圖1：菌體量的不同引起的回收量的變化（JM109 / pUC18，MMI培養(yǎng)液）
過少 適量 過多
圖2：菌體量的標(biāo)準(zhǔn)
5．試劑的制備
·溶解液
請按照4:1（v:v）的比例對試劑盒中的溶解液Ⅰ*1，Ⅱ進行混合。請將此混合液在室溫下保存，三周后請勿繼續(xù)使用*2。通過手動法抽提的時候需要150μg / 樣品。使用MFX-2000的時候，請參考第九頁的表【各試劑的使用劑量標(biāo)準(zhǔn)】進行制備。
·70％乙醇溶液
只有在使用手動法的時候使用。需要1500μg / 樣品。
6．使用MFX-2000抽提Plasmid DNA的方法
在使用MFX-2000前，請務(wù)必閱讀MFX-2000的使用說明書。使用抽提程序中的”Dryup”或”Fullauto”程序時，需要有加溫的功能*3。請使用標(biāo)準(zhǔn)式樣（加溫，簡易保溫功能 / Code No.：MFX-102）或者是特殊式樣（加溫，電子冷卻功能 / Code No：MFX-103）。
（1）操作程序的選擇
MFX-2000中準(zhǔn)備了4種可供抽提Plasmid DNA用的操作程序。選擇其中一個，將其號碼輸入在液晶畫面中。
·一次操作只能選擇其中一個操作程序。
·下表的抽提時間不包含分裝時間。實際的抽提時間根據(jù)樣品不同
會有所變化，以下表的抽提時間 x 樣品數(shù) x 1.25（小時）為標(biāo)準(zhǔn)。
|
號碼
|
液晶畫面的第3行顯示的內(nèi)容
|
樣品
|
抽提
時間
|
用途*1
|
|
|
A
|
B
|
||||
|
31
|
[Plasmid： Speedy]
|
再次懸濁液
|
10min
|
○
|
∆*2
|
|
32
|
[Plasmid： Dryup]
|
再次懸濁液
|
15min
|
○
|
○
|
|
33
|
[Plasmid： Fullauto]
|
集菌后的菌體
|
16min
|
○
|
○
|
|
34
|
[Plasmid： Lowcost]
|
菌體抽提液
|
6min
|
○
|
∆
|
*1 用途A：用于限制酶處理，轉(zhuǎn)化
用途B：DNA 測序，或使用回收液超過50％時的反應(yīng)。
*2 通過手動法進行去除乙醇的操作后便可以進行DNA 測序。
*1 有析出物的場合，請在室溫～40℃中徹底溶解。
*2 Plasmid DNA的回收量和純度有時會降低。
*3 如果只使用”Dryup”或”Fullauto”操作程序，請使用基本樣式的
MFX-2000（簡易保溫功能 / Code：MFX-101）。
·操作程序 “31：Speed”
適用于限制酶處理以及轉(zhuǎn)化用Plasmid DNA的制備。將再次懸濁液置于MFX-2000中，大約在10min / 樣品下抽提出Plasmid。
·操作程序 “32：Dryup” “33：Fullauto”
適用于DNA 測序用Plasmid DNA的制備。處理較多菌體（7～9O.D.）時適合使用針對再次懸濁液的 “32：Dryup”，處理較少菌
時（5～6O.D.）時適合使用針對集菌后的菌體的“33：Fullauto”。
·操作程序 “34：Lowcost”
使用通過以下的操作設(shè)置處理過的樣品。由于僅使用專用試管1個/樣品（其他操作程序時3～4個），故能夠以較低成本回收Plasmid DNA，
并能夠在6min / 樣品下實現(xiàn)限制酶處理，以及轉(zhuǎn)化用的Plasmid DNA的制備。
集菌后的菌體
|←150μl再次懸浮液
| 用漩渦混合器攪拌60sec
|←150μl溶解液（溶解液Ⅰ，Ⅱ按4：1（v：v）的比例混合后的溶液）
| 反復(fù)顛倒試管5次以實現(xiàn)攪拌
| 放置于冰上5min
|←120μl中和液
| 反復(fù)顛倒試管5次以實現(xiàn)攪拌
| 放置于冰上5min
| 12,000rpm，10min
設(shè)定MFX-2000
（2）加溫block，回收block的溫度設(shè)定*1
|
|
加溫block
|
冷卻block
|
|
溫度設(shè)定
|
78℃
|
10℃
|
·簡易冷卻時，冷卻block應(yīng)事先在冷藏庫或者冷凍庫內(nèi)冷卻。
（3）附帶專用過濾器的tip頭設(shè)置
·請使用附帶專用過濾器的tip頭（Code No：MFX-402）
·tip已通過γ射線滅菌。戴上手套將需要量專用tip安裝在tip架中。
·關(guān)于tip的安裝位置請閱讀MFX-2000的使用說明書。
*1 設(shè)定方法請閱讀MFX-2000的使用說明書。
·將需要量專用tip安裝在tip架中。
|
|
tip數(shù)
|
|
tip數(shù)
|
||||||||
|
操作程序號
|
31
|
32
|
33
|
34
|
操作程序號
|
31
|
32
|
33
|
34
|
||
|
樣品數(shù)
|
1
|
10
|
11
|
11
|
5
|
樣品數(shù)
|
13
|
61
|
74
|
74
|
26
|
|
2
|
13
|
15
|
15
|
6
|
14
|
64
|
78
|
78
|
27
|
||
|
3
|
16
|
19
|
19
|
7
|
15
|
67
|
82
|
82
|
28
|
||
|
4
|
19
|
23
|
23
|
8
|
16
|
70
|
86
|
86
|
29
|
||
|
5
|
27
|
32
|
32
|
12
|
17
|
78
|
95
|
95
|
33
|
||
|
6
|
30
|
36
|
36
|
13
|
18
|
81
|
99
|
99
|
34
|
||
|
7
|
33
|
40
|
40
|
14
|
19
|
84
|
103
|
103
|
35
|
||
|
8
|
36
|
44
|
44
|
15
|
20
|
87
|
107
|
107
|
36
|
||
|
9
|
44
|
53
|
53
|
19
|
21
|
95
|
116
|
116
|
40
|
||
|
10
|
47
|
57
|
57
|
20
|
22
|
98
|
120
|
120
|
41
|
||
|
11
|
50
|
61
|
61
|
21
|
23
|
101
|
124
|
124
|
42
|
||
|
12
|
53
|
65
|
65
|
22
|
24
|
104
|
128
|
128
|
43
|
||
（4）專用試管的設(shè)置
·請將專用試管設(shè)置在抽提架中。擺放位置根據(jù)操作程序的不同
而有所差異，請按照下表放置試管。
|
操作程序號
|
擺放場所
|
|
31～33
|
A. B. C. D. E. F
|
|
34
|
A. B. C. D
|
·請對加溫block（只限于操作程序32，33），回收block設(shè)置所需樣品數(shù)。
·對抽提架的A～F以及加溫block，請勿使用專用試管以外的其他
試管。否則有可能會產(chǎn)生故障。
·對于回收block，請使用Assist公司的No.72.730試管。*1
*1 對于回收block，除了MFX-2000專用試管外，帶螺旋式蓋的1.5ml試管Assist試管No.72.692等也能使用。由于回收液中會有不同程度的磁珠殘留，回收液超過50％的場合下，請對這些試管進行12,000rpm×2min的離心操作（如果回收液在反應(yīng)液中的比例小于50％則不會存在問題。）
（5）試劑的設(shè)置
·本試劑盒內(nèi)不含有滅菌水和乙醇溶液（99.5％以上的特級品），請
自己準(zhǔn)備。
·請準(zhǔn)備50ml容量試管FALCON 2170，15ml容量試管FALCON
2196，2ml容量試管Assist試管No.72.694。*1
·根據(jù)樣品數(shù)的不同所需的試劑量也會不同。請根據(jù)第九頁的表，在
指定試管內(nèi)注入所需試劑的必要劑量。
·注入試劑時請以試管上的刻度為標(biāo)準(zhǔn)。
·視操作程序，有可能不需要安裝某些試劑。
·將各試管放置在試劑架中。請將磁珠Ⅰ，Ⅱ再次搖勻，放置
在試劑架處。磁珠設(shè)置好后，請立刻啟動裝置（10分鐘以內(nèi)）。
（否則將產(chǎn)生回收量參差不齊及操作故障。）
·抽提后剩下的試劑可以再次使用（可追加減去的量并設(shè)置在MFX－2000上）。如果不再接下去使用，請將蓋子蓋好保存。如果長時間處于蓋子打開狀態(tài)，液體的組成成分有可能會起變化。
·使用的劑量請不要超過第九頁表中記載的規(guī)定劑量。這是造成試管
塞污染以及液體溢出的原因。
*1 使用其他物品會造成儀器運作不穩(wěn)定。
【樣品數(shù)在1～12時的試劑使用劑量】
|
試劑名
|
試管容量
|
分裝量（ml）
|
設(shè)置
位置
|
|||
|
操作程序號
|
||||||
|
31
|
32
|
33
|
34
|
|||
|
吸附液
|
50ml
|
25
|
25
|
25
|
25
|
1
|
|
滅菌水
|
50ml
|
25
|
25
|
25
|
25
|
2
|
|
乙醇溶液
|
50ml
|
25
|
25
|
25
|
25
|
6
|
|
磁珠Ⅰ
|
2ml
|
1.5
|
1.5
|
1.5
|
不要
|
7
|
|
磁珠Ⅱ
|
2ml
|
1.5
|
1.5
|
1.5
|
1.5
|
8
|
|
再次懸濁液
|
15ml
|
不要
|
不要
|
5
|
不要
|
9
|
|
溶解液
|
15ml
|
5
|
5
|
5
|
不要
|
10
|
|
中和液
|
15ml
|
5
|
5
|
5
|
不要
|
11
|
|
溶出液
|
15ml
|
5
|
5
|
5
|
5
|
12
|
【樣品數(shù)在13～24時的試劑使用劑量】
|
試劑名
|
試管
容量
|
分裝量（ml）
|
設(shè)置
位置
|
|||
|
操作程序號
|
||||||
|
31
|
32
|
33
|
34
|
|||
|
吸附液
|
50ml
|
25
|
25
|
25
|
25
|
1
|
|
滅菌水
|
50ml
|
25
|
25
|
25
|
25
|
2
|
|
乙醇溶液
|
50ml
|
50
|
50
|
50
|
50
|
6
|
|
磁珠Ⅰ
|
2ml
|
1.5
|
1.5
|
1.5
|
不要
|
7
|
|
磁珠Ⅱ
|
2ml
|
1.5
|
1.5
|
1.5
|
1.5
|
8
|
|
再次懸濁液
|
15ml
|
不要
|
不要
|
5
|
不要
|
9
|
|
溶解液
|
15ml
|
5
|
5
|
5
|
不要
|
10
|
|
中和液
|
15ml
|
5
|
5
|
5
|
不要
|
11
|
|
溶出液
|
15ml
|
5
|
5
|
5
|
5
|
12
|
（6）樣品的前處理及其設(shè)置
根據(jù)操作程序需要對以下樣品進行前期處理。
①使用程序31,32時
集菌后的菌體
|←150μl再次懸濁液
| 用漩渦混合器攪拌60sec
置于樣品孔
②使用程序33時
·把集菌后的菌體原樣放入樣品孔。
③使用程序34時
集菌后的菌體
|←150μl再次懸濁液
| 用漩渦混合器攪拌60sec
|←150μl溶解液（溶解液Ⅰ，Ⅱ按4:1（v:v）比例混合后的溶液）
| 反復(fù)顛倒試管5次以攪拌
| 放置于冰上5min
|←120μl中和液
| 反復(fù)顛倒試管5次以攪拌
| 放置于冰上5min
| 12,000rpm，10min
置于樣品孔*1
·將樣品放入樣品孔時，請保持試管蓋開啟狀態(tài)（1～24號樣品的樣
品孔上印有號碼）。
·樣品試管使用通常的1.5ml試管時，請先用剪子如下圖所示進行剪斷后再使用。剪斷的時候請務(wù)必注意安全。
請在此處剪斷
*1 菌體殘渣留在試管壁上時，試管仍然可以繼續(xù)使用。由于rotor有時會使得菌體殘渣留在試管底部，所以請將上清液置于其他試管后再進行使用。
（7）抽提開始
·請確認樣品，試劑試管（試劑量），試管種類，專用tip等是否已
按說明書所示安裝完畢。
·抽提之前，請先將tip廢棄盒清空。
·確認各臺架的安裝位置（鎖定），確認操作臺是否已完全收納到里
面，并將前門關(guān)閉。
·在液晶畫面上輸入操作程序的號碼以及樣品數(shù)。
·確認顯示有“請按下開始鍵”的畫面內(nèi)容后，按下“START”
按鍵。
·抽提操作開始時，液晶畫面會顯示“操作中”字樣。
·手伸進驅(qū)動部位會有危險，因此操作中請務(wù)必關(guān)好前門，不要開啟。
（8）樣品回收
·所有抽提操作結(jié)束后，會再次顯示“請按下開始鍵”字樣的畫面。
·抽提的DNA被回收block上的試管回收。確認裝置完全停止運行
后，從回收block塊上取出試管，將其在低溫（4～10℃）下保存，直至使用為止。
·如果回收液中混入少量的磁珠，仍可以直接使用。
·從加溫block上取出試管時，請確認加溫block的開關(guān)是否已關(guān)閉并且溫度已下降至40℃以下。如果在加溫block尚熱的時候去取試管，有可能發(fā)生燙傷。
（9）通過手動法抽提plasmid DNA的方法
①操作程序Ⅰ（限制酶處理，轉(zhuǎn)化等級）
集菌后的菌體
|←150μl再次懸濁液
| 用漩渦混合器攪拌60sec
|←150μl溶解液（溶解液Ⅰ，Ⅱ按4:1(v:v)比例混合后的溶液）
| 反復(fù)顛倒試管5次以攪拌
| 放置于冰上5min
|←120μl中和液
| 反復(fù)顛倒試管5次以攪拌
| 放置于冰上5min
| 12,000rpm，5min
| 將上清液放入新的1.5ml試管中
|←500μl吸附液
|←30μl磁珠Ⅱ（反復(fù)顛倒攪拌，使其均勻混合）
| 攪拌60sec *1
| B/F分離 *2
|←720μl70％乙醇溶液
| 攪拌30sec 重復(fù)兩次
| B/F分離
|←50μl溶出液
| 攪拌60sec
| 12,000rpm，5min
| B/F分離
上清液
②操作程序Ⅱ（DNA 測序等級）
集菌后的菌體
|←150μl再次懸濁液
| 用漩渦混合器攪拌60sec
|←150μl溶解液（溶解液Ⅰ，Ⅱ按4:1(v:v)比例混合后的溶液）
| 反復(fù)顛倒試管5次以攪拌
| 放置于冰上5min
|←120μl中和液
| 反復(fù)顛倒試管5次以攪拌
*1 將攪拌強度設(shè)為最大，在室溫下用漩渦混合器或試管混合器進行攪
拌。
*2 將試管置于磁性臺架上，磁珠靠近磁石，多次顛倒混合，使得蓋子
上的磁珠完全貼近磁石。然后，輕輕震動磁性臺架，使得粘在蓋子上
的溶液摔落下來。用微量移液器吸棄上清部分。
| 放置于冰上5min
| 12,000rpm，5min
| 將上清液放入新的1.5ml試管中
|←500μl吸附液
|←30μl磁珠Ⅱ（反復(fù)顛倒攪拌，使其均勻混合）
| 攪拌60sec
| B/F分離
|←720μl70％乙醇溶液
| 攪拌30sec 重復(fù)兩次
| B/F分離
|←500μl乙醇溶液
| 攪拌30sec
| B/F分離
| 78℃，15min（使磁珠干燥）
|←50μl溶出液
| 攪拌60sec
| 12,000rpm，5min
| B/F分離
上清液
[5] 一般樣品的分析
（1）A260，A280，A320的測定
·請將回收液瞬時高速離心后進行測定。
·請用TE緩沖液的10～30倍稀釋后進行測定。
（2）電泳
·5x Loading Dye：樣品：電泳緩沖液＝按2：3：5～2：7：1比
例稀釋。
（3）DNA 測序
·按照操作程序32，33抽提出的DNA以及按照手動操作程序Ⅱ抽提出的DNA，請使用5～10μl用于反應(yīng)。
·按照操作程序31，34抽提出的DNA以及按照手動操作程序Ⅰ抽提出的DNA，其中混有10％濃度的乙醇溶液，會阻礙測序反應(yīng)，請先去除乙醇。
·將樣品15μl注入到0.5ml試管內(nèi)。
·以78℃的溫度加溫直至液體蒸發(fā)完（約15min），然后用此試管混
合反應(yīng)液。
[6] 疑難解答
1．使用MFX-2000的場合
（1）plasmid DNA的回收量少，純度差
|
原因
|
對策
|
|
試劑量不足
|
在C, D, E孔中B/F分離后會分別剩下800μl，720μl及720μl 左右的試劑。如果此溶液量過少的話，則原因是使用的試劑量不足。請加液到規(guī)定劑量。如果回收液過少或者沒有，有可能是沒有安裝溶出液或溶出液少的緣故。
|
|
樣品量過多
|
A, B孔的抽提試管中剩有50μl以上的液體時，可能是因為菌體量過多，無法用專用tip吸走。請使用9 O.D.以下的菌體。
|
2．使用手動操作的場合
(1) plasmid DNA的回收量少
|
原因
|
對策
|
|
磁珠Ⅱ的使用量過少
|
請使用磁珠Ⅱ的規(guī)定劑量。
|
|
吸附液的使用量過少
|
請使用吸附液的規(guī)定劑量。
|
|
用70％以下濃度的乙醇溶液清洗磁珠，或者清洗時間過長
|
請用70％乙醇溶液洗凈。清洗請不要超過1min。
|
|
溶出液過少
|
請使用50μl以上的溶出液。
|
|
Plasmid DNA的拷貝數(shù)過少
|
使用手動法的情況下，請增加抽提規(guī)模。菌體量，試劑的使用量可以增加至2倍。不過溶出液也會因此而增加，故回收濃度不會上升。
|
（2）Plasmid DNA純度差
|
原因
|
對策
|
|
菌體的溶解，殘渣的凝聚工序不能正常進行
|
請使用規(guī)定的溶解工序時間及溶解液劑量。此工序下的純度如果偏低，吸附·洗凈時的磁珠就會難以分散，回收液的純度也會因此變差。
|
|
用70％以上濃度的乙醇溶液來清洗磁珠，或者洗凈時間過短。
|
請用70％乙醇溶液清洗，直至磁珠完全分散（1min）。
|
