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微生物及無菌知識培訓
一、前言
我們所生活的環(huán)境中，到處都存在著大量的微生物。在一般空氣中，微生物達800~ 3500個/m3,在土壤中達1~500*108個/g，在嚴重污染的水中可達107個/mL。( 飲用水要求細菌總數(shù)≤100個/mL,大腸桿菌≤3個/mL。經水塔或貯水池貯存后，短期內可繁殖至105~106個/ml。)人的頭皮上有140萬個/cm2，兩手上約有4~40萬個，1g指甲污垢38億個，1g糞便可達10~1000億個。
可以說微生物是無處不在，無處不有。許多以前被人們認為是極端(高溫、高壓、強酸、強堿、低溫等)甚至是致死的環(huán)境，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)生活著各種類型的微生物(稱為極端微生物)。事實說明，微生物有特別頑強的生存、繁殖和變異能力來適應環(huán)境。
微生物種類繁多，有的對人有益，有的有害，有的無益也無害。但在藥品生產過程中，不可能對環(huán)境中的各種微生物加以區(qū)別對待，為保證食品的安全有效，需要對其進行控制。空氣中的微生物多數(shù)附著在灰塵上，或以芽孢形式懸浮于空氣中，1μm以下者處于懸浮狀態(tài)，10μm以上者會逐漸沉下來而形成菌塵。所以也要對塵粒進行控制。
人是潔凈室最大的污染源，占90%左右。一般男性每人每分鐘向周圍排放1000個以上的含菌粒子，女性為750個以上。穿無菌服時，靜止時的發(fā)菌量為10~ 300個/min,一般活動時發(fā)菌量為150~ 1000個/min,行走時發(fā)菌量為900~ 2500個/min。咳嗽一次發(fā)菌量為70~700個/min,噴嚏一次為4000~60000個/min。所以在潔凈室中，人的數(shù)量和活動應有特別嚴格的限制。
二、微生物簡介
微生物在自然界中的分布極為廣泛，空氣、土壤、江河、湖泊、海洋等都有數(shù)量不等、種類不一的微生物存在。在人類、動物和植物的體表及其與外界相通的腔道中也有多種微生物存在。
絕大多數(shù)微生物對人類和動、植物的生存是有益而必需的。自然界中氮、碳、硫等多種元素循環(huán)靠微生物的代謝活動來進行。例如空氣中的大量氮氣只有依靠微生物的作用才能被植物吸收，土壤中的微生物能將動、植物蛋白質轉化為無機含氮化合物，以供植物生長的需要，而植物又為人類和動物所利用。因此，沒有微生物，植物就不能新陳代謝，而人類和動物也將無法生存。
另一方面，中極少數(shù)微生物引起的傳染病發(fā)病快、死亡率高、傳播迅速、傳播范圍廣，嚴重危害著人民健康。
微生物是廣泛存在于自然界的一群體形微小 (直徑小于1mm)、結構簡單、肉眼看不見，必須借助光學或電子顯微鏡放大數(shù)百至數(shù)萬倍才能觀察到的生物。需要說明的是，微生物是一個比較籠統(tǒng)的概念，界線有時非常模糊。如單細胞藻類和一些原生動物也應算是微生物，但通常它們并不放在微生物中進行研究。
微生物具有以下特點:①體積小，面積大;②吸收多，轉化快(2000倍體重/h) ;③生長旺，繁殖快(20min分裂一次) ;④易變異，適應強;⑤分布廣，種類多(10萬種以上)。
微生物按其結構、化學組成及生活習性等差異可分成三大類:
1.真核細胞型
細胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體;胞質內有完整的細胞器(如內質網、核糖體及線粒體等)。真菌屬于此類型微生物。
2.原核細胞型
細胞核分化程度低，僅有原始核質，沒有核膜與核仁:細胞器不很完善。這類微生物種類眾多，有細菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體和放線菌。
3.非細胞型
沒有典型的細胞結構，亦無產生能量的酶系統(tǒng)，只能在活細胞內生長繁殖。體積微小，能通過除菌濾器。病毒屬于此類型微生物。
三、微生物的形態(tài)結構
1.細菌(原核單細胞生物)
細菌按形狀可分為:球菌(0.5~2μm) 、桿菌(長1~5μm， 寬0.3~1μm) 和螺形菌(大小與桿菌相似)。
按革蘭氏染色法染色的不同，分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌的細胞壁表面含較多的磷壁酸，會產生外毒素，如金黃色葡萄球菌;革蘭氏陰性菌的細胞壁表面多含脂蛋白和脂多糖，會產生內毒素(即熱原)，如大腸桿菌。
細菌一般有細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核，有的還有莢膜、鞭毛、菌毛和芽胞等特殊結構。
細菌一般為無性繁殖，以二分法繁殖，兒十分鐘或1~2小時分裂次。
資料:關于芽孢
在溫度逐漸降低或營養(yǎng)缺乏時，芽胞桿菌屬(如炭疽桿菌)及梭狀芽胞桿菌屬(如破傷風桿菌)能在菌體內形成一個折光性很強的不易著色小體，稱為芽胞，芽胞是處于休眠狀態(tài)的細菌，并非細菌的繁殖體，當環(huán)境適宜時，可恢復生長繁殖。
芽胞在自然界分布廣泛，要注意防止污染。芽胞的抵抗力強，對熱力、干燥、輻射、化學消毒劑等理化因素均有強大的抵抗力，用一般的方法不易將其條死。有的芽胞可耐100C沸水煮沸數(shù)小時。
殺滅芽胞最可靠的方法是高壓蒸汽滅菌。當進行消毒滅菌時往往以芽胞是否被殺死作為判斷滅菌效果的指標。
2.霉菌(絲狀真菌的通稱，真核多細胞生物)
霉菌是真菌的一部分。在培養(yǎng)基上長成絨毛狀或棉絮狀的菌絲體的真菌統(tǒng)稱為霉菌。
霉菌細胞呈狹長的管狀，稱為菌絲，菌絲直徑比細菌、放線菌大，約2~10um。菌絲分枝連接，交錯集合在一起的總體稱為菌絲體。
霉菌大多數(shù)是多細胞微生物，菌絲細胞由細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核和各種細胞器組成。細胞壁很薄，往往在表面產生色素，使菌落出現(xiàn)各種顏色。
霉菌靠孢子繁殖，有無性繁殖和有性繁殖兩種方式，以無性繁殖為主。有些真菌可用釀酒造醬，或用于發(fā)酵生產檸檬酸、葡萄糖酸、酶、抗生素(如青霉素、頭孢菌素) ;少數(shù)真菌能引起各種真菌病。真菌產生的真菌毒素(如黃曲霉素)有毒。
3.酵母菌(真核單細胞生物，屬真菌)
酵母菌以單細胞存在，呈圓形、卵圓形和香腸形，比細菌天，細胞長5~ 30um,寬1~5um。細胞結構有細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核和各種細胞器等。
酵母菌的增殖分無性繁殖和有性繁殖兩個階段，有三種方式:芽殖、裂殖、孢子生殖。
酵母菌是重要的工業(yè)微生物，用于釀酒，生產單細胞蛋白、B族維生素、核酸、輔酶A、細胞色素C等。一般對人體無害。
4.放線菌(原核單細胞生物)
放線菌有生長發(fā)育良好的菌絲體，呈分枝狀，菌絲寬為0.2~1.2um,革蘭氏陽性。其內部構造與細菌相似，無完整的細胞核。菌落常星幅射狀，因此稱放線菌。
繁殖方式為無性孢子 繁殖。最適pH6.7~7.5, 溫度25~ 30°C。
放線菌可用于生產抗生素、維生素和酶類，少數(shù)可引起人畜放線菌病。
5.病毒
病毒是一類體積十分微小，結構簡單，只含一種核酸(DNA或RNA)，沒有產生能量的酶系統(tǒng)，只能在活細胞內以復制方式增殖的非細胞型微生物。病毒在自然界分布非常廣泛，在所有其它生物中都有病毒寄居。病毒是最常見的致病微生物，人類傳染病中大約75%是由病毒引起的。
病毒體主要由核酸和蛋白質組成。病毒體積微小，最大直徑300nm (如牛痘病毒)，最小直徑20nm(如口蹄疫病毒) ，絕大多數(shù)在150nm以下，能通過細菌濾器，用普通光學顯微鏡看不見，必須用電子顯微鏡放大數(shù)千至數(shù)萬倍才能看見。形態(tài)多呈球形，少數(shù)為桿狀或磚形。噬菌體(細菌病毒)有呈蝌蚪狀的。
四、微生物的營養(yǎng)
1.水分:
水占細胞漿的70%~ 90%，是細胞的重要組成成分。較普遍的觀點認為:只有在含水的環(huán)境中微生物才能存活。但也有人發(fā)現(xiàn)在無水碳氫化合物中微生物可長期存活。
2.碳源:
碳源是構成細胞的重要物質。有些微生物的碳源必須來自有機碳化合物如糖、蛋白質、脂肪、有機酸等(同時利用其化學能)，屬異養(yǎng)型;有些微生物不需有機碳化合物，以CO2為碳源，屬自養(yǎng)型(分為光能自養(yǎng)型和化能自養(yǎng)型)。
3.氮源:
氮是組成蛋白質和核酸的重要元素。
4.無機鹽類:
細菌所需無機鹽包括磷、硫、鎂、鐵、鉀、鈉、鈣、氯、錳、鋅、鉆、銅等。其中磷、硫、鎂、鉀、鈉、鐵需要量較多，其他只需微量。
5.生長因子:
生長因子是某些微生物生長發(fā)育所必需，而其自身又不能合成的一類營養(yǎng)物質包括維生素、嘌呤和嘧啶等。
五、微生物生長的影響因素
1.營養(yǎng)物：
2.pH值:
各種微生物都有其最適宜的pH值，大多數(shù)細菌最適pH6.8~7.4，但一般有較大的容忍度，在4~9也可存活和生長，少數(shù)細菌能在極端pH值范圍內生長。真菌適于pH值3~6的微酸性環(huán)境，但在2~10也可生長。
3.溫度:
微生物適于生長繁殖要有適宜的溫度，當超過其最低或最高可耐受的溫度時，即停止生長或死亡。一般細菌最適溫度為30~40℃，真菌為20~30℃。
4.氧氣:
大多數(shù)細菌和所有霉菌都是需氧菌(在有氧環(huán)境中才能生長)，少數(shù)細菌是厭氧菌(在無氧環(huán)境中才能生長)，有些細菌和酵母菌是兼性需氧厭氧的，在有氧或無氧環(huán)境中都能生長繁殖。
5.滲透壓:
微生物細胞膜和所有生物膜一樣是一種半透膜，可讓水自由通過，對溶質則有選擇性。由于細胞壁的保護，微生物能存活在低滲透壓的水中。而在高滲溶液(如高濃度的鹽溶液或糖溶液、40%甘油)中，細胞會脫水并停止生長繁殖。但也有一些專性耐高鹽細菌只有在高鹽(10~15%)條件下才生長。
6.表面張力:
表面活性劑可降低表面張力它是影響細菌生長的因素之一。很多革蘭氏陰性菌，特別是大腸菌群可很好地在表血活性劑包圍的介質中生長，而大多數(shù)革蘭氏陽性菌在表面張力低時(0.05N/m)不能很好生長。陽離子表面活性劑對很多有機體有毒性，陰離子表面活性劑毒性很小，非離子表面活性劑幾乎沒有毒性，并可成為某此微生物的營養(yǎng)物。
六、消毒與滅菌
消毒和滅菌兩個詞在實際使用中常被混用，其實它們的含義是有所不同的。消毒是指應用消毒劑等方法殺滅物體表面和內部的病原菌營養(yǎng)體的方法，而滅菌是指用物理和化學方法殺死物體表面和內部的所有微生物，使之呈無菌狀態(tài)。
（一）消毒是指殺滅或清除傳播媒介上的病原微生物，使之達到無害化的處理。根據有無已知的傳染源可分預防性消毒和疫源性消毒；根據消毒的時間可分為隨時消毒和終末消毒。
（二）滅菌是指殺滅或清除傳播媒介上的所有微生物（包括芽胞），使之達到無菌程度。經過滅菌的物品稱“無菌物品”。
消毒與滅菌是兩個不同的要領。
滅菌可包括消毒，而消毒卻不能代替滅菌。消毒通常用于實驗室檢測環(huán)境、人員手部等，滅菌通常用于檢測用具、檢測試劑等。
常用滅菌法
1、干熱滅菌法
常見的有火焰、燒灼、干烤和紅外線滅菌等。
①火焰、燒灼:通常用于實驗室無菌操作中金屬或其它耐火材料制成的器具的滅菌。
②干烤和紅外線:利用干熱空氣或熱輻射進行滅菌。一般135~ 145℃需3~5h, 160~ 170℃需2h以上，170~ 180℃需1h以上，180~ 200℃需0.5~1h。除熱原則需250℃ 30min,或200℃ 45min, 180℃ 2h。
空氣傳熱慢，穿透力不強，故干熱滅菌時間長。
干熱滅菌時烤箱內裝入物品應留有空隙，以利空氣流動，否則使箱內溫度不均，部分物品滅菌不徹底。
2、濕熱滅菌法
通過熱蒸汽或沸水使蛋白質變性而殺滅微生物的方法。濕熱穿透力強，滅菌效果較干熱好。
①煮沸或流通蒸汽滅菌:常壓下沸水和蒸汽的溫度是100℃，般處理30~60min可殺死細菌繁殖體，但不能完全殺滅芽孢。此法適用于不能高壓蒸汽滅菌的物品。
②低溫間隙滅菌(巴斯德滅菌法)：將物品先用60~ 80℃加熱(或煮沸) 1h, 然后置20~25℃保存24h(或常溫過夜)，使其中殘存的芽孢萌發(fā)成繁殖體，再用以上條件滅菌，如此反復三次。本法適用于不耐高溫或高溫下易變質的物品，但很費時。
③高壓蒸汽滅菌(熱壓滅菌法) :超過一個大氣壓時，水的沸點高于100℃，反之亦然。
高壓蒸汽滅菌就是通過加壓提高蒸汽溫度，滅菌效果最好。它簡便、經濟、可靠、無毒，是最可靠、應用最廣泛的滅菌法。此法適用于耐高溫和潮濕的物品。常用條件為:
115.5℃ 30min
121.5℃ 20min
126.5℃ 15min
注意事項:
a.必須完全排出滅菌器內的空氣。否則會影響滅菌器內溫度達到規(guī)定的要求。
b.注意被滅菌物品的溫度。滅菌器內溫度與被滅菌物品的溫度般是一致的，但在蒸汽輸入過快時，后者可能低于前者，所以升溫時要有一定的預熱時間。另外，降溫過快易引起玻璃炸裂。因此，對于一種滅菌產品，應制定固定的滅菌曲線(象凍干曲線樣)。
c.定期檢查滅菌器內溫度的準確性。
3、化學滅菌法
利用化學試劑形成的氣體來殺滅微生物的方法。常用的滅菌劑為環(huán)氧乙烷(又稱氧化乙烯)。
4、濾過除菌法
利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理，除去對熱不穩(wěn)定的藥品溶液或液體物質中的細菌的方法。過濾法般只能除菌，不能除去支原體和病毒。
過濾除菌的效果與濾膜的性能、孔徑的大小、密度、濾膜的厚度等因素有關。
濾過除菌法要求最終過濾的濾膜孔徑為0.22pm。由于各廠家生產的相同規(guī)格的濾膜質量并不一致，為了保證除菌效果，在使用前后應檢查濾器的完好性(如壓力維持試驗或起泡點試驗)。一個過濾器的使用時間應根據品種驗證后確定，一般不應超過8小時。
5、輻射滅菌法
輻射有兩種類型:一種是電磁波輻射，如紫外線、紅外線、微波;一種是電離輻射，如可引起被照射物電離的X射線、y射線。
①紫外線:紫外光波長在136~ 390nm之間，其中260nm左石能破壞核酸，殺菌作用最強。
另外，空氣中的氧受紫外線照射后，可微量轉變?yōu)槌粞豕餐饸⒕饔谩Ｗ贤饩�消毒的效果與光源的功率、光源與被照射物的距離、照射時間、溫度和濕度等因素有關。我國規(guī)定紫外燈照射強度在距離1m處不低于70pW/cm2(以紫外線測強儀測定)
在操作面上要求強度達40μW/cm2以上。一般每10m2裝30W燈管1支，工作前開30~ 60min。紫外燈的輸出功率隨使用時間增加而降低。國產紫外燈的平均壽命(點到70%額定功率的時間)一般為2000h,超過平均壽命時，就達不到預期效果，必須更換。
紫外線的穿透力很弱，不能穿透一般包裝材料，如玻璃、塑料薄膜、紙等。玻璃能強烈吸收小于350nm的紫外線，石英玻璃能吸收小于200nm的紫外線。因此，它主要用于空氣和物體表面消毒，特制的紫外燈裝置也可用于水的消毒。
②紅外線:通過加熱碳化硅板產生的輻射熱能，由空氣傳導加熱滅菌。如紅外線烤箱，溫度可達180℃左右。熱效應特點是由表及里。
③微波:微波滅菌主要是因其熱效應。微波加熱升溫快，溫度高且均勻，殺菌作用強。熱效應特點是由里及表。不同性質的物品吸收微波的能力不同，其熱效應和消毒效果也不同。
微波有一定穿透力，但不強。微波對人體有害，要注意防護。
④60Co滅菌:放射性同位素60Co (或137Cs)衰變時可放射出y射線，p射線的能量高、穿透力強，可使細胞內各種活性物質發(fā)生化學變化，從而使細菌損傷或死亡。經60Co輻射滅菌的物品溫度升高很少，一般僅約5℃，故又稱“冷滅菌”
60Co輻射存在兩個方面的安全問題:一是輻射的直接作用。y射線對人體細胞同樣有害;二是經過輻射的食品、藥品的安全性。1984年美國農業(yè)部食品安全實驗室用輻射處理的雞肉喂飼小鼠，發(fā)現(xiàn)患**腫瘤增加，包括加重癌病損害。因此60Co輻射用于食品和藥品都應經過安全試驗，進行科學的、全面的評價，高劑量的輻射藥品更應慎重。
美國藥典規(guī)定25kGy為有效滅菌劑量。1997年我國衛(wèi)生部頒發(fā)了60Co中藥滅菌標準，該標準限國內流通中藥可用60Co輻照滅菌，規(guī)定了允許輻照的藥材和中成藥的品種和劑量。
六步洗手法
科學的六步洗手法是在平時防止交叉污染的關鍵。現(xiàn)做以下介紹:
第一步：掌心相對，手指并攏相互進行摩擦。
第二步：手心對手背沿指縫相互進行搓擦，交換進行。
第三步：掌心相對，雙手交叉沿指縫相互進行摩擦。
第四步：一只手握住另一只手的大拇指進行旋轉搓擦，交換進行。
第五步：彎曲各手指關節(jié)，在另一手掌心進行旋轉搓擦，交換進行。
第六步：一手指尖在另一手掌心進行轉動，交換進行。
注意要全程用流水清洗。
人員無菌意識培訓
1、GMP對衛(wèi)生的要求
人是永不休止的恒定污染源
人體自身產生的微粒、微生物
人體攜帶的微粒、微生物
運動、操作等產生的污染
人員不能滅菌除菌，
人員不能消毒,
人是污染潔凈室的主要威脅
2、穿無菌衣時，靜止時的發(fā)菌量為10~300個( min/人)
進入潔凈室的人員必須按要求更衣(戴口罩、戴無菌手套等)
對鏡進行整衣，盡可能的包裏身體的全部以減少發(fā)菌量和發(fā)塵量。
減少走動，活動幅度要小，拿東西要輕拿輕放
不按規(guī)定進行著裝的人員、未按規(guī)定清潔的物品禁止進入潔凈區(qū)。
生產人員不得裸手直接接觸藥品, A級潔凈區(qū)內操作人員不得裸手操作,并定時消毒。
其他操作人員以及稱量人員一定要有無菌意識操作,戴手套后不得任意接觸其它物品,按規(guī)定進行手消毒。
